Ett protokoll presenteras för att upptäcka cirkulerande äggstocks tumörceller med hjälp av en skräddarsydd Fotoakustisk flöde system och riktade folsyra-täckta koppar sulfid nanopartiklar.
Många studier tyder på att uppräkning av cirkulerande tumörceller (CTCs) kan visa löfte som ett prognostiskt verktyg för äggstockscancer. Aktuella strategier för detektion av ctcs inkluderar flödescytometri, mikroflödessystem enheter, och realtid polymeras kedjereaktion (RT-PCR). Trots de senaste framstegen, metoder för detektion av tidig äggstockscancer metastaser saknar fortfarande den känslighet och specificitet som krävs för klinisk översättning. Här, en ny metod presenteras för detektion av ovariella cirkulerande tumörceller av photoacoustic Flow flödescytometrianalys (pafc) utnyttjar en anpassad tredimensionell (3D) tryckt system, inklusive en flödes kammare och spruta pump. Denna metod använder folsyra-utjämnade koppar sulfid nanopartiklar (FA-CuS NPs) att rikta SKOV-3 äggstockscancer celler av PAFC. Detta arbete visar affinitet av dessa kontrastmedel för äggstockscancer celler. Resultaten visar NP-karakterisering, PAFC-detektion och NP-upptag genom fluorescensmikroskopi, vilket visar potentialen hos detta nya system för att detektera äggstocks-CTCs vid fysiologiskt relevanta koncentrationer.
Äggstockscancer är en av de dödligaste gynekologiska maligniteter och resulterade i uppskattningsvis 184 800 dödsfall över hela världen i 20181. Flera studier har visat sambandet mellan äggstockscancer progression (dvs., metastaser) och närvaron av ctcs2,3,4. Den vanligaste metoden för detektion och isolering av CTCs utnyttjar CELLSEARCH-systemet, som är inriktat på EpCam-receptorn5. EpCam uttryck, emellertid, är nedreglerad i epitelial till mesenkymala övergång, som har varit inblandad i cancermetastaser6. Trots framstegen lider den nuvarande kliniska tekniken fortfarande av låg noggrannhet, höga kostnader och komplexitet. På grund av dessa nackdelar har ny teknik för upptäckt och uppräkning av äggstocks-CTCs blivit ett viktigt forskningsområde.
Nyligen framträdde pafc som en effektiv metod för noninvasiv detektion av cancerceller, analys av nanomaterial, och identifiering av bakterier7,8,9. PAFC skiljer sig från traditionell fluorescensflödescytometri genom att detektera analyter i flödet genom att använda fotoakustik. Den fotoakustiska effekten genereras när laserljus absorberas av ett material som orsakar termoelastisk expansion, som producerar en akustisk våg som kan detekteras av en ultraljudsgivare10,11. Fördelarna med pafc över traditionella flödescytometri metoder inkluderar enkelhet, enkel översättning till kliniska inställningar, och detektion av ctcs på exempellösa djup i patientprover12,13. Nyligen genomförda studier har utnyttjat pafc-system för detektion av celler med endogena och EXOGEN kontrast14,15. Nära infraröd (NIR) ljus-absorberande kontrastmedel såsom indocyaningrönt grön färg, och metall NPS (t. ex., guld och CUS) har använts för selektiv märkning av celler och vävnader i kombination med Fotoakustisk avbildning16,17,18. På grund av det förbättrade penetrationsdjupet av NIR-ljus inom biologiska vävnader kan Fotoakustisk detektering av absorbenter utföras på större djup för kliniska tillämpningar. På grund av sin stora potential för användning på kliniken, har kombinationen av riktade NIR kontrastmedel med PAFC genererat stort intresse för detektion av CTCs.
PAFC i kombination med riktade kontrastmedel ger en förbättrad metod för högt genomflöde analys av patientprover med förbättrad noggrannhet och riktad detektion av CTCs. En av de viktigaste detektions strategierna för CTCs är den specifika inriktningen av membranproteiner som finns på cellen av intresse. Ett anmärkningsvärt kännetecken för äggstockarna CTCs är överuttryck av folat receptorer ligger på deras yttre membran19. Folat receptor inriktning är en idealisk strategi för identifiering av äggstockarna CTCs i blodet eftersom endogena celler, som har högre uttryck av folsyra receptorer, är i allmänhet luminala och har begränsad exponering för blodomloppet20. Koppar sulfid NPs (CuS NPs) har nyligen erkänts för deras förmåga att rikta folat receptorer uttryckt på cancerceller21. Kombinerat med deras biokompatibilitet, enkel syntes, och absorption djupt i NIR, dessa NP kontrastmedel gör en idealisk inriktning strategi för detektion av äggstockscancer CTCs utnyttjar PAFC.
Detta arbete beskriver utarbetandet av FA-CuS NPs och deras användning för detektion av äggstockscancer celler i ett foto akustiskt flöde system. CuS NPs modifieras med folsyra för att specifikt rikta äggstocks-CTCs och avge en Fotoakustisk signal när den stimuleras med en 1 053 nm-Laser. Resultaten visar att den framgångsrika upptäckten av äggstockscancer celler inkuberas med dessa foto akustiska kontrastmedel inom PAFC-systemet. Dessa resultat visar detektion av äggstockscancer celler ner till koncentrationer av 1 cell/μL, och fluorescens mikroskopi bekräftar framgångsrikt upptag av dessa partiklar av SKOV-3 äggstockscancer celler22. Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av FA-CuS NPs syntes, beredning av prover för fluorescens mikroskopi, konstruktion av photoacoustic Flow system, och Fotoakustisk detektering av äggstockscancer celler. Den presenterade metoden visar framgångsrik identifiering av äggstocks-CTCs i flödet med hjälp av FA-CuS NPs. framtida arbete kommer att inriktas på den kliniska tillämpningen av denna teknik mot tidig upptäckt av äggstockscancer metastaser.
Detta protokoll är en enkel metod för detektion av äggstocks-CTCs använder PAFC och en riktad CuS kontrastmedel. Många metoder har utforskats för detektion av äggstocks-ctcs, inklusive mikroflödessystem enheter, RT-PCR, och fluorescens flödescytometri23,24,25. Dessa intervall i komplexitet, kostnad och noggrannhet, begränsa deras effektivitet i kliniska inställningar. PAFC introducerar flera fördelar jämfört med de…
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja erkänna Madeleine Howell för hennes hjälp med syntes, Matthew Chest för hans hjälp med att designa Flow system, och Ethan Marschall för hjälp med SolidWorks.
0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
3D Printed Tank | Custom-made | ||
Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |