सह-संस्कृतियों में एम 1 मैक्रोफेज-4T1 माउस मैमेरी कार्सिनोमा कोशिकाओं में फागोसाइटिक गतिविधि की समय-चूक 2डी इमेजिंग
Summary
कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ मैक्रोफेज फागोसाइटिक गतिविधि, विशेष रूप से 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं, इस अध्ययन में चित्रित किया गया था । लाइव सेल सहसंस्कृति मॉडल की स्थापना की और फ्लोरोसेंट और अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी के संयोजन का उपयोग कर मनाया गया था । मल्टीपॉइंट टाइम-लैप्स वीडियो विकसित करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इस मूल्यांकन को चित्रित किया गया था।
Abstract
ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) ट्यूमर के विकास, आक्रमण, मेटास्टासिस, और कैंसर चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के लिए एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में पहचान की गई है । हालांकि, ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के आधार पर ट्यूमर के लिए हानिकारक हो सकते हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिक गतिविधि का विरोध करके या एंटी-ट्यूमर प्रतिक्रिया को बढ़ाने से अपनी फेनोटाइपिक विशेषताओं को बदल सकते हैं। मैक्रोफेज के आणविक कार्यों और ट्यूमर कोशिकाओं (जैसे, फागोसाइटोसिस) के साथ उनकी बातचीत का बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है। इसलिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं (M1/M2-subtype टैम) और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में कैंसर कोशिकाओं के बीच बातचीत अब कैंसर इम्यूनोथेरेपी अनुसंधान का ध्यान केंद्रित है । वर्तमान अध्ययन में, प्रेरित एम 1 मैक्रोफेज और माउस मैमेरी 4T1 कार्सिनोमा कोशिकाओं का एक लाइव सेल सहसंस्कृति मॉडल चरण-विपरीत, फ्लोरोसेंट, और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक समय-चूक वीडियो सुविधा का उपयोग करके मैक्रोफेज की फागोसाइटिक गतिविधि का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था। वर्तमान विधि का निरीक्षण और दस्तावेज मल्टीपॉइंट लाइव-सेल इमेजिंग फेगोसाइटोसिस कर सकता है। एम1 मैक्रोफेज द्वारा 4T1 कोशिकाओं के फागोसाइटोसिस को कार्बोसिफ्लोरेसिन सिसिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) के साथ 4T1 कोशिकाओं को धुंधला करने से पहले फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है। वर्तमान प्रकाशन का वर्णन कैसे एक ही इमेजिंग डिश में मैक्रोफेज और ट्यूमर कोशिकाओं सहसंस्कृति के लिए, ध्रुवीकरण M1 मैक्रोफेज, और मैक्रोफेज की रिकॉर्ड बहुबिंदु घटनाओं को 13 घंटे के दौरान 4T1 कोशिकाओं छा ।
Introduction
मैक्रोफेज प्रतिरक्षा रक्षा की पहली पंक्ति हैं और कैंसर कोशिकाओं सहित रोगजनकों और विदेशी सामग्रियों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आर्केस्ट्रा में भूमिका निभाते हैं। वे एक विशेष फागोसाइट हैं जो शरीर में अवांछित कणों को नष्ट कर देता है और छुटकारा पा ता है। मैक्रोफेज एपोप्टोटिक कोशिकाओं और सूक्ष्मजीवों की निकासी और अन्य प्रतिरक्षाकोशिकाओंकी भर्ती जैसे रक्षात्मक कार्यों का योगदान करते हैं । मैक्रोफेज पर्यावरणीय संकेतों2के जवाब में दो अलग-अलग प्रकार, एम 1 और एम 2 मैक्रोफेज में अंतर कर सकते हैं। M1-polarized मैक्रोफेज (यानी, शास्त्रीय रूप से सक्रिय मैक्रोफेज) साइटोकिन इंटरफेरॉन-ए(आईएफएन-ए) और लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस) द्वारा सक्रिय होते हैं और भड़काऊ प्रतिक्रिया, रोगजनक निकासी, कुशल फैगोसाइटोसिस, और ट्यूमरीडल प्रतिरक्षा3,4में शामिल होते हैं। M2 मैक्रोफेज ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) से निकटता से संबंधित हैं और इसमें एंटी-भड़काऊ और ट्यूमर प्रमोशन गुण4हैं।
फागोसाइटोसिस, प्राचीन ग्रीक (phagein) से व्युत्पन्न, जिसका अर्थ है “खा,” (kytos), जिसका अर्थ है “सेल,” और-ओसिस, जिसका अर्थ है “प्रक्रिया”5। फागोसाइटोसिस एक रिसेप्टर-मध्यस्थता प्रक्रिया है जहां फागोसाइट्स (मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल सहित) रोगजनकों पर हमला करने, विदेशी कणों को साफ करने और स्पष्ट अपोप्टिक सेल मलबे को मारते हैं और निगल जाते हैं। ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टीएएमएस) स्तन कैंसर सहित विभिन्न ट्यूमर में स्ट्रोमा में पाए जाते हैं, और ट्यूमर प्रो-ट्यूमर कार्य6,7होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फागोसाइटोसिस का प्रतिरोध होता है। मैक्रोफेज द्वारा ट्यूमर सेल फागोसाइटोसिस का विस्तृत तंत्र अभी तक समझ में नहीं आया है।
यह अध्ययन एक दो चरण विधि प्रस्तुत करता है: 1) 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और M1-polarized मैक्रोफेज cocultured हैं, और 2) मैक्रोफेज की फागोसाइटिक गतिविधि लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है । सीएफएस फ्लोरोसेंट डाया का उपयोग 4T1 माउस मैमैरी कार्सिनोमा कोशिकाओं को दाग देने के लिए किया गया था। दाग लेबल 4T1 कोशिकाओं को एक ही इमेजिंग डिश के भीतर cocultured M1 मैक्रोफेज से अलग करने के लिए । रॉ 264.7 मैक्रोफेज एलपीएस और आईएफएन-ए के साथ एम 1 फेनोटाइप में ध्रुवीकृत हैं। पूर्ण ध्रुवीकरण सुनिश्चित करने के लिए, फिच के लिए संयुग्मित एंटी-आईनोस एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया। बाद में, सहसंस्कृति के भीतर फागोसाइटोसिस सहित कई घटनाओं का निरीक्षण करने के लिए समय-चूक छवियों की एक बहुबिंदु श्रृंखला का अधिग्रहण किया गया था।
ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच बातचीत की बेहतर समझ संभावित कैंसर इम्यूनोथेरेपी का कारण बन सकती है। लाइव-सेल इमेजिंग वास्तविक समय की स्थापना में सेलुलर गतिशीलता का एक विस्तृत दृश्य प्रदान करता है और इसका उपयोग तंत्रिका विज्ञान, विकासात्मक जीव विज्ञान और दवा खोज में सेल माइग्रेशन, फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग, एपोप्टोसिस और साइटोटॉक्सिकिटी8,9 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। हालांकि इस अध्ययन में प्रस्तावित ट्यूमर स्तन कैंसर है, विधि भी कई लक्ष्य कोशिकाओं और अलग प्रभावक कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल के लिए दो चरणों की आवश्यकता होती है: 1) 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और एम 1-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज की सहसंस्कृति, और 2) समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मैक्रोफेज फागोसाइटिक गतिविधि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आर्थिक रूप से गेरन पुत्र Berimpak (GBP), विश्वविद्यालयों पुत्र मलेशिया: ९५४२८०० द्वारा वित्त पोषित किया गया था । हम कृषि जैव प्रौद्योगिकी संस्थान, मलेशिया (एबीआई) प्रयोगशालाओं, और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । संपादन और इस काम के लिए प्रयोगात्मक वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ मदद के लिए मोहम्मद डैनियल Hazim के लिए विशेष धन्यवाद।
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
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