Time-lapse 2D-beeldvorming van fagocytische activiteit in M1 macrophage-4T1 muis borstkanker cellen in co-culturen
Summary
Macrofaag fagocytische activiteit tegen kankercellen, in het bijzonder 4T1 muis borstklier carcinoom cellen, werd afgebeeld in deze studie. Het cocultuurmodel van de levende cellen werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. Deze beoordeling is gemaakt met behulp van imaging software om multipoint time-lapse-video te ontwikkelen.
Abstract
Tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) zijn geïdentificeerd als een belangrijk onderdeel voor tumorgroei, invasie, metastase, en resistentie tegen kankertherapieën. Echter, tumor-geassocieerde macrofagen kunnen schadelijk zijn voor de tumor afhankelijk van de tumor micro omgeving en kunnen reversibel veranderen hun fenotypische kenmerken door ofwel van de cytotoxische activiteit van immune cellen of verbetering van de anti-tumor reactie. De moleculaire acties van macrofagen en hun interacties met tumorcellen (bijv. fagocytose) zijn niet uitvoerig bestudeerd. Daarom is de interactie tussen immune cellen (M1/M2-subtype TAM) en kankercellen in de tumor micro omgeving nu een focus van kanker immunotherapie onderzoek. In de huidige studie werd een levend celcocultuurmodel van geïnduceerde M1 macrofagen en muizen borst 4t1 carcinoom ontwikkeld om de fagocytische activiteit van macrofagen te beoordelen met behulp van een time-lapse video-functie met behulp van phase-contrast, fluorescerende en differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie. De huidige methode kan multipoint Live-celbeeldvorming van phagocytose observeren en documenteren. Fagocytose van 4T1 cellen door M1 macrofagen kan worden waargenomen met behulp van fluorescerende microscopie voordat kleuring 4T1 cellen met carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE). De huidige publicatie beschrijft hoe macrofagen en tumorcellen samen te brengen in een enkele beeldvormings schotel, polariseren M1 macrofagen, en opnemen multi punt gebeurtenissen van macrofagen engulfing 4T1 cellen tijdens 13 h van coculture.
Introduction
Macrofagen zijn de eerste regel van immuun verdediging en spelen een rol bij het indelen van immuunresponsen tegen pathogenen en vreemde materialen, met inbegrip van kankercellen. Ze zijn een gespecialiseerde fagocyte die vernietigt en verlost van ongewenste deeltjes in het lichaam. Macrofagen dragen defensieve functies zoals de klaring van apoptotische cellen en micro-organismen en de werving van andere immuuncellen1. Macrofagen kunnen zich onderscheiden in twee verschillende types, M1 en m2 macrofagen, als reactie op omgevings signalen2. M1-gepolariseerde macrofagen (d.w.z. klassiek geactiveerde macrofagen) worden geactiveerd door de cytokine interferon-γ (IFN-γ) en lipopolysacchariden (LPS) en zijn betrokken bij de ontstekingsreactie, pathogeen klaring, efficiënte fagocytose en tumoricide immuniteit3,4. De m2 macrofagen zijn nauw verwant aan tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) en hebben anti-inflammatoire en tumor promotie-eigenschappen4.
Phagocytose, afgeleid van het Oudgrieks (phagein), wat “tot verser” betekent (kyto’s), wat betekent “cel”, en-ose, wat betekent “proces”5. Fagocytose is een receptor-gemedieerde proces waarbij fagocyten (waaronder macrofagen, monocyten en neutrofielen) doden en overspoelen van ziekteverwekkers, opruimen van vreemde deeltjes, en duidelijke apoptotic celpuin. Tumor-geassocieerde macrofagen (TAMS) zijn te vinden in de stroma in verschillende tumoren, met inbegrip van borstkanker, en hebben Pro-tumor functies6,7, resulterend in resistentie tegen fagocytose. Het gedetailleerde mechanisme van tumor cel fagocytose door macrofagen is nog niet begrepen.
Deze studie presenteert een tweestapsmethode: 1) 4T1 muis borstkanker cellen en M1-gepolariseerde macrofagen worden gecoculeerd, en 2) de fagocytische activiteit van de macrofagen wordt beoordeeld met behulp van Live-cel video microscopie. CFSE fluorescerende kleurstof werd gebruikt om de 4T1 muis borstkanker cellen vlekken. De vlek etiketten 4T1 cellen om ze te onderscheiden van de gecocultiveerde M1 macrofagen binnen een enkele beeldvormings schaal. RAW 264,7 macrofagen zijn gepolariseerd met LPS en IFN-γ in een M1 fenotype. Om een volledige polarisatie te waarborgen, werd immunokleuring met anti-iNOS antilichaam geconjugeerd aan FITC uitgevoerd. Vervolgens werd een multipoint-reeks timelapse-beelden verworven om meerdere gebeurtenissen te observeren, waaronder fagocytose, binnen de cocultuur.
Een beter begrip van de interacties tussen tumorcellen en macrofagen kan leiden tot mogelijke kanker immunotherapie. Live-Cell Imaging biedt een gedetailleerd beeld van cellulaire dynamiek in een real-time setting en is gebruikt voor het bestuderen van Celmigratie, fenotypische screening, apoptosis en cytotoxiciteit8,9 in neurowetenschappen, ontwikkelingsbiologie en geneesmiddelen ontdekking. Hoewel de voorgestelde tumor in deze studie borstkanker is, kan de methode ook worden toegepast op meerdere doelcellen en afzonderlijke Effector cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het beschreven protocol vereist twee stappen: 1) cocultuur van 4T1 muizen-borstkanker cellen en M1-gepolariseerde macrofagen, en 2) beoordeling van de macrofaag fagocytische activiteit met behulp van timelapse-microscopie. Live Cell coculture wordt veel gebruikt in fagocytose en Migratietesten. Het Live Cell coculture model hier is een eenvoudige, aanpasbare in vitro procedure (Figuur 2) die gebruik maakt van een fluorescerende kleurstof, CFSE, die wordt gebruikt om de 4T1-doelcellen te labe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel gefinancierd door Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. We willen graag het agro-biotechnologie Instituut, Maleisië (ABI) laboratoria en microscopie Imaging Facility bedanken. Speciale dank aan Mohd Daniel Hazim voor hulp bij het bewerken en opnemen van de experimentele video voor dit werk.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
