M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징
Summary
암세포, 특히 4T1 마우스 유방 암종 세포에 대한 대식세포 식세포 활성은 본 연구에서 영상화되었다. 살아있는 세포 동배 모델은 형광및 차동 간섭 대조 현미경의 조합을 사용하여 확립되고 관찰되었다. 이 평가는 이미징 소프트웨어를 사용하여 멀티포인트 타임랩스 비디오를 개발하는 데 사용되었습니다.
Abstract
종양 관련 대식세포 (TAM)는 종양 성장, 침략, 전이 및 암 치료에 대한 저항성을 위한 중요한 구성 요소로 확인되었습니다. 그러나, 종양 관련 대식세포는 종양 미세 환경에 따라 종양에 유해할 수 있고 면역 세포의 세포 독성 활성을 길항하거나 항종양 반응을 강화함으로써 그들의 자형질 특성을 가역적으로 변경할 수 있다. 대식세포의 분자 작용과 종양 세포와의 상호 작용 (예를 들어, 식균증)은 광범위하게 연구되지 않았습니다. 따라서, 종양 미세 환경에서 면역 세포 (M1/M2 아류형 TAM)와 암 세포 사이의 상호 작용은 이제 암 면역 요법 연구의 초점이된다. 본 연구에서, 유도된 M1 대식세포 및 마우스 유방 4T1 암종 세포의 살아있는 세포 동배 모델은 상 대비, 형광, 및 차동 간섭 대조(DIC) 현미경을 사용하여 시간 경과 비디오 기능을 사용하여 대식세포의 식세포 활성을 평가하기 위해 개발되었다. 본 방법은 식세포증의 멀티포인트 라이브 셀 이미징을 관찰하고 문서화할 수 있다. M1 대식세포에 의한 4T1 세포의 식세포증은 카르복시플루오레세인 슈치니미딜 에스테르(CFSE)로 4T1 세포를 염색하기 전에 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있다. 현재 간행물은 단일 이미징 접시에 대식세포 및 종양 세포를 동배하는 방법, M1 대식세포를 편광하고, 13시간 동안 4T1 세포를 포위하는 대식세포의 다점 사건을 기록하는 방법을 설명합니다.
Introduction
대식세포는 면역 방어의 첫번째 선이고 암세포를 포함하여 병원체 및 이물질에 대하여 면역 반응을 조율하는 역할을 합니다. 그들은 파괴하고 몸에 원치 않는 입자를 제거하는 전문 식세포입니다. 대식세포는 세포사멸세포및미생물의클리어비큐비와 다른면역세포의 모집과 같은 방어적 기능을 기여한다1. 대식세포는 환경 신호2에대한 응답으로 M1 및 M2 대식세포두 가지 유형으로 구분할 수 있다. M1 편광 대식세포(즉, 고전적으로 활성화된 대식세포)는 사이토카인 인터페론-γ(IFN-γ) 및 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 활성화되며 염증 반응, 병원균 클리어런스, 효율적인 식세포증 및 종양성면역에관여한다3,4. M2 대식세포는 종양 관련 대식세포(TAM)와 밀접한 관련이 있으며 항염증 및 종양 촉진 특성을 갖는다4.
고대 그리스어 (파게인)에서 파생 된 식균증은 “삼키기”(kytos)를 의미하며 ,”세포”를의미하고 -osis를 의미하며 “과정”5 . 식세포증은 식세포(대식세포, 단핵구 및 호중구 포함)가 침입하는 병원균을 죽이고 삼키고, 이물질을 제거하고, 세포 사멸 세포 파편을 지우는 수용체 매개 과정입니다. 종양 관련 대식세포(TAM)는 유방암을 포함한 다른 종양의 기질에서 발견되며, 친종양 기능이6,7,식세포증에 대한 내성을 초래한다. 대식세포에 의한 종양 세포 식세포증의 상세한 기전은 아직 이해되지 않았다.
본 연구는 2단계 방법을 제시한다: 1) 4) 4T1 마우스 유방 암종 세포 및 M1 편광 대식세포는 공동 배양되고, 2) 대식세포의 식세포 활성은 살아있는 세포 비디오 현미경을 사용하여 평가된다. CFSE 형광 염료는 4T1 마우스 유방 암종 세포를 염색하기 위해 사용되었다. 얼룩은 4T1 세포를 단일 이미징 접시 내의 배양 된 M1 대식세포와 구별합니다. RAW 264.7 대식세포는 LPS 및 IFN-γ로 M1 표현형으로 편광된다. 완전한 분극을 보장하기 위해, FITC에 공액된 항 iNOS 항체로 면역 염색을 수행하였습니다. 그 후, 시간 경과 이미지의 멀티 포인트 시리즈는 공동 배양 내에서 식세포증을 포함한 여러 이벤트를 관찰하기 위해 인수되었다.
종양 세포와 대식세포 사이 상호 작용의 더 나은 이해는 잠재적인 암 면역 요법으로 이끌어 낼 수 있습니다. 살아있는 세포 화상 진찰은 실시간 조정에 있는 세포 역학의 상세한 보기를 제안하고 신경과학, 발달 생물학 및 약 발견에 있는 세포 이동, phenotypic 검열, apoptosis 및 세포 독성8,9를 공부하는 것을 이용되었습니다. 본 연구에서 제안된 종양은 유방암이지만, 이 방법은 또한 다중 표적 세포 및 뚜렷한 이펙터 세포에 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기재된 프로토콜은 2단계를 필요로 한다: 1) 4T1 마우스 유방암종 세포 및 M1 편광 대식세포의 공동배양, 2) 타임랩스 현미경을 이용한 대식세포 식세포 활성의 평가. 살아있는 세포 동문화는 식세포증 및 이동 세포 세포에서 널리 사용된다. 여기서 살아있는 세포 동배 모델은 4T1 표적 세포를표지하는 데 사용되는 형광 염료, CFSE를 활용하는 간단하고 적응력이 있는 체외 시술(?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 재정적으로 제란 푸트라 Berimpak에 의해 투자되었다 (GBP), 대학 푸트라 말레이시아: 9542800. 우리는 농업 생명 공학 연구소, 말레이시아 (ABI) 실험실 및 현미경 이미징 시설에 감사드립니다. 이 작품에 대한 실험 비디오를 편집하고 녹화하는 데 도움을 주어 Mohd Daniel Hazim에게 특별한 감사를 드립니다.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
