Time-lapse 2D-avbildning av fagocytos aktivitet i M1 Makrofage-4T1 mus bröstcancerceller i Co-kulturer
Summary
Makrofage fagocytos aktivitet mot cancerceller, specifikt 4T1 mus bröstcancerceller, var avbildad i denna studie. Den levande cell coculture modellen fastställdes och observerades med hjälp av en kombination av fluorescerande och differentiell interferens kontrast mikroskopi. Denna bedömning avbildades med hjälp av avbildningsprogram för att utveckla Multipoint Time-lapse video.
Abstract
Tumör-associerade makrofager (TAMs) har identifierats som en viktig komponent för tumörtillväxt, invasion, metastaser, och resistens mot cancerterapier. Emellertid, tumör-associerade makrofager kan vara skadligt för tumören beroende på tumören mikromiljö och kan reversibelt förändra deras fenotypiska egenskaper genom att antingen motarbeta den cytotoxiska aktiviteten av immunceller eller förbättra anti-tumörrespons. De molekylära åtgärderna för makrofager och deras interaktioner med tumörceller (t. ex. fagocytos) har inte studerats ingående. Därför är samspelet mellan immunceller (M1/M2-subtyp Tam) och cancerceller i tumören mikromiljö nu ett fokus för cancer immunterapi forskning. I den nuvarande studien, en levande cell samodling modell av inducerad M1 makrofager och mus bröst 4T1 carcinoma celler utvecklades för att bedöma fagocytos aktivitet av makrofager med hjälp av en time-lapse video funktion med hjälp av fas-kontrast, fluorescerande, och differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi. Den nuvarande metoden kan observera och dokumentera Multipoint Live-cell Imaging av fagocytos. Fagocytos av 4T1 celler av M1 makrofager kan observeras med hjälp av fluorescerande mikroskopi innan färgning 4T1 celler med karboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE). Den aktuella publikationen beskriver hur man samodlar makrofager och tumörceller i en enda avbildning skålen, polarisera M1 makrofager, och spela in Multipoint händelser av makrofager uppsluka 4T1 celler under 13 h av coculture.
Introduction
Makrofager är den första raden av immunförsvaret och spela en roll i Iscensätt immunsvar mot patogener och främmande material, inklusive cancerceller. De är en specialiserad fagocyt som förstör och blir av med oönskade partiklar i kroppen. Makrofager bidra defensiva funktioner såsom clearance av apoptotiska celler och mikroorganismer och rekrytering av andra immunceller1. Makrofager kan differentiera i två olika typer, M1 och m2 makrofager, som svar på Miljösignaler2. M1-polariserade makrofager (dvs. klassiskt aktiverade makrofager) aktiveras av cytokin interferon-γ (IFN-γ) och lipopolysackarider (LPS) och är involverade i den inflammatoriska reaktionen, patogen clearance, effektiv fagocytos, och tumoricidal immunitet3,4. Den m2 makrofager är nära besläktade med tumör-associerade makrofager (TAMs) och har anti-inflammatoriska och tumörfrämjande egenskaper4.
Fagocytos, härstammar från antikens grekiska (phagein), som betyder “att sluta”, (kytos), som betyder “cell” och-Osis, som betyder “process”5. Fagocytos är en receptor-medierad process där fagocyter (inklusive makrofager, monocyter, och neutrofiler) döda och uppslukar invaderande patogener, städa upp främmande partiklar, och klar apoptotiska cell skräp. Tumör-associerade makrofager (Tams) finns i stroma i olika tumörer, inklusive bröstcancer, och har Pro-tumör funktioner6,7, vilket resulterar i resistens mot fagocytos. Den detaljerade mekanismen för tumör cell fagocytos av makrofager är ännu inte förstått.
Denna studie presenterar en två-stegs metod: 1) 4T1 mus bröstcancerceller och M1-polariserade makrofager är coculodlade, och 2) den fagocytiska aktiviteten av makrofager bedöms med hjälp av levande cell video mikroskopi. Cfse fluorescerande färgämne användes för att färga 4T1 mus bröst carcinoma celler. Fläcken etiketter 4T1 celler för att skilja dem från coculodlade M1 makrofager inom en enda avbildning skålen. RÅ 264,7 makrofager är polariserat med LPS och IFN-γ till en M1 fenotyp. För att säkerställa en fullständig polarisering, immunofärgning med anti-iNOS antikropp konjugerat till FITC utfördes. Därefter, en Multipoint serie av tidsförlopp bilder förvärvades för att observera flera händelser, inklusive fagocytos, inom coculture.
En bättre förståelse av samspelet mellan tumörceller och makrofager kan leda till potentiell cancer immunoterapi. Live-cell Imaging erbjuder en detaljerad bild av cellulära dynamik i realtid inställning och har använts för att studera cell migration, fenotypisk screening, apoptos, och cytotoxicitet8,9 i neurovetenskap, utvecklingsbiologi, och Drug discovery. Även om den föreslagna tumören i denna studie är bröstcancer, metoden kan också tillämpas på flera målceller och distinkta effektorceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som beskrivs kräver två steg: 1) samodling av 4T1 mus bröstcancerceller och M1-polariserade makrofager, och 2) bedömning av makrofagen fagocytos aktivitet med hjälp av Time-lapse mikroskopi. Levande cell coculture används ofta i fagocytos och migrationsanalyser. Den levande cell coculture modell här är en enkel, anpassningsbar in vitro-förfarande (figur 2) som använder ett fluorescerande färgämne, cfse, som används för att märka 4T1 riktade celler. Detta används…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades ekonomiskt av Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Vi vill tacka Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) laboratorier, och mikroskopi Imaging anläggning. Speciellt tack till Mohd Daniel hazim för hjälp med redigering och inspelning av experimentell video för detta arbete.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
