Time-lapse 2D billeddannelse af Fagocytisk aktivitet i M1 Macrophage-4T1 mus mammary karcinom celler i co-kulturer
Summary
Makrofag Fagocytisk aktivitet mod cancerceller, specifikt 4t1 mus-karcinom celler i brystcancer, blev afbildet i dette studie. Den levende celle coculture model blev etableret og observeret ved hjælp af en kombination af fluorescerende og differentiel interferens kontrast mikroskopi. Denne vurdering blev afbildet ved hjælp af imaging software til at udvikle multipoint time-lapse video.
Abstract
Tumor-associerede makrofager (TAMs) er blevet identificeret som en vigtig komponent for tumorvækst, invasion, metastase, og resistens over for kræft behandlinger. Men, tumor-associerede makrofager kan være skadeligt for tumoren afhængigt af tumor mikromiljø og kan reversibelt ændre deres fænotypiske egenskaber ved enten antagonisere den cytotoksiske aktivitet af immunceller eller øge anti-tumorrespons. De molekylære handlinger af makrofager og deres interaktioner med tumorceller (f. eks, fagocytose) er ikke blevet grundigt undersøgt. Derfor er samspillet mellem immunceller (M1/M2-subtype TAM) og kræftceller i tumor mikromiljøet nu et fokus for kræft immunterapi forskning. I nærværende undersøgelse, en levende celle coculture model af induceret M1 makrofager og mus bryst 4t1 karcinom celler blev udviklet til at vurdere den fagocytiske aktivitet af makrofager ved hjælp af en time-lapse videofunktion ved hjælp af fase-kontrast, fluorescerende, og differential interferens kontrast (dic) mikroskopi. Den nuværende metode kan observere og dokumentere multipunkts Live-Cell Imaging af fagocytose. Fagocytose af 4T1 celler af M1 makrofager kan observeres ved hjælp af fluorescerende mikroskopi før farvning 4T1 celler med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). Den aktuelle publikation beskriver, hvordan man coculture makrofager og tumorceller i en enkelt billedbehandlings skål, polariserer M1 makrofager, og optage multipunkt hændelser af makrofager opslugende 4T1 celler under 13 h af coculture.
Introduction
Makrofager er den første linje i immunforsvaret og spiller en rolle i orkestratering immunrespons mod patogener og fremmede materialer, herunder kræftceller. De er en specialiseret fagocyt, der ødelægger og slipper af uønskede partikler i kroppen. Makrofager bidrager med defensive funktioner såsom clearance af apoptotiske celler og mikroorganismer og rekruttering af andre immunceller1. Makrofager kan differentiere i to forskellige typer, M1 og m2 makrofager, som reaktion på Miljøsignaler2. M1-polariserede makrofager (dvs. klassisk aktiverede makrofager) aktiveres af cytokin interferon-γ (IFN-γ) og lipopolysaccharider (LPS) og er involveret i den inflammatoriske respons, patogen clearance, effektiv fagocytose og tumoricidal immunitet3,4. M2 makrofager er nært beslægtet med tumor-associerede makrofager (TAMs) og har anti-inflammatoriske og tumor forfremmelse egenskaber4.
Fagocytose, afledt af oldgræsk (phagein), hvilket betyder “at fortæde,” (kytos), hvilket betyder “celle” og-Ose, hvilket betyder “proces”5. Fagocytose er en Receptor-medieret proces, hvor fagocytter (herunder makrofager, monocytter, og neutrofiler) dræbe og opsluge invaderer patogener, rydde op fremmede partikler, og klar apoptotiske celle snavs. Tumor-associerede makrofager (Tams) findes i stroma i forskellige tumorer, herunder brystkræft, og har Pro-tumor funktioner6,7, resulterer i resistens over for fagocytose. Den detaljerede mekanisme af tumor celle fagocytose af makrofager er endnu ikke forstået.
Denne undersøgelse præsenterer en to-trins metode: 1) 4t1 mus brystkarcinom celler og M1-polariserede makrofager er kulturperler, og 2) den fagocytiske aktivitet af makrofager vurderes ved hjælp af Live-Cell video mikroskopi. Cfse fluorescerende farvestof blev brugt til at plette 4t1 mus brystkarcinom celler. Pletten etiketter 4T1 celler til at skelne dem fra de kulturperler M1 makrofager i en enkeltbilled skål. RÅ 264,7 makrofager er polariseret med LPS og IFN-γ i en M1 fænotype. For at sikre en komplet polarisering blev der udført immun farvning med anti-iNOS antistof konjugeret til FITC. Efterfølgende blev en multipunkts serie af time-lapse-billeder erhvervet for at observere flere begivenheder, herunder fagocytose, inden for coculture.
En bedre forståelse af samspillet mellem tumorceller og makrofager kan føre til potentiel kræft immunterapi. Live-Cell Imaging tilbyder en detaljeret visning af cellulære dynamik i en real-time indstilling og er blevet brugt til at studere celle migration, fænotypiske screening, apoptose, og cytotoksicitet8,9 i neurovidenskab, udviklingsmæssige biologi, og Drug Discovery. Selv om den foreslåede tumor i denne undersøgelse er brystkræft, metoden kan også anvendes til flere målceller og særskilte Effector celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokol kræver to trin: 1) coculture af 4t1 mus brystkarcinom celler og M1-polariserede makrofager, og 2) vurdering af makrofag Fagocytisk aktivitet ved hjælp af tidsforskudt mikroskopi. Levende celle coculture er meget udbredt i fagocytose og migration assays. Den levende celle coculture model her er en enkel, fleksibel in vitro-procedure (figur 2), der udnytter en fluorescerende farvestof, cfse, som bruges til at mærke 4T1 målrettede celler. Dette bruges til korrekt spor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansielt finansieret af Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Vi vil gerne takke Agro-bioteknologi Institute, Malaysia (ABI) laboratorier, og mikroskopi Imaging facilitet. Særlig tak til Mohd Daniel Hazim for at få hjælp til at redigere og indspille den eksperimentelle video til dette arbejde.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
