Denne protokollen beskriver en metode for å spore individuelle hjernealdringsbaner gjennom et hjernedonasjonsprogram og riktig karakterisering av hjernen. Hjernedonorer er involvert i en langsiktig langtidsstudie, inkludert serielle flerdimensjonale vurderinger. Protokollen inneholder en detaljert beskrivelse av hjernebehandling og en nøyaktig diagnostisk metodikk.
I en stadig aldrende befolkning forventes forekomsten av nevrodegenerative lidelser å stige. Å forstå sykdomsmekanismer er nøkkelen til å finne forebyggende og kurative tiltak. Den mest effektive måten å oppnå dette på er gjennom direkte undersøkelse av sykt og sunt hjernevev. Forfatterne presenterer en protokoll for å oppnå, behandle, karakterisere og lagre hjernevev av god kvalitet donert av personer registrert i et antemortem hjernedonasjonsprogram. Donasjonsprogrammet inkluderer en ansikt-til-ansikt empatisk tilnærming til mennesker, en samling av komplementær klinisk, biologisk, sosial og livsstilsinformasjon og serielle flerdimensjonale vurderinger over tid for å spore individuelle baner av normal aldring og kognitiv nedgang. Siden mange nevrologiske sykdommer er asymmetriske, tilbyr hjernebanken vår en unik protokoll for å kutte ferske prøver. Hjernedeler av begge halvkuler er vekselvis frosset (ved -80 °C) eller fast i formalin; et fast stykke på den ene halvkule tilsvarer en frossen på den andre halvkule. Med denne tilnærmingen kan en fullstendig histologisk karakterisering av alt frossent materiale oppnås, og omics-studier kan utføres på histologisk veldefinerte vev fra begge halvkuler og dermed tilby en mer fullstendig vurdering av nevrodegenerative sykdomsmekanismer. Korrekt og bestemt diagnose av disse sykdommene kan bare oppnås ved å kombinere det kliniske syndromet med nevropatologisk evaluering, noe som ofte legger til viktige etiologiske ledetråder som er nødvendige for å tolke patogenesen. Denne metoden kan være tidkrevende, dyrt og begrenset som det bare dekker et begrenset geografisk område. Uavhengig av begrensningene kan den høye graden av karakterisering det gir være givende. Vårt endelige mål er å etablere den første italienske hjernebanken, samtidig som vi understreker viktigheten av nevropatologisk verifiserte epidemiologiske studier.
Ifølge WHO lider om lag 50 millioner mennesker for tiden av demens, et tall som forventes å tredobles innen 2050. Alzheimers sykdom er den viktigste årsaken til demens, etterfulgt av cerebrovaskulær sykdom og andre aldersrelaterte nevrodegenerative lidelser. I 2017 utviklet WHO Global Dementia Observatory for å øke bevisstheten om demens og oppmuntre til en global handlingsplan mot det1. Hver enkelt har sin egen hjerne aldring bane, derfor kan søket etter kur være utfordrende på grunn av kompleksiteten i patogenesen av nevrodegenerative sykdommer. Kanskje har hver person sin egen patogenese skrevet i hjernevevet som krever en personlig tilnærming. Dermed vil studiet av hjernevev være nøkkelen til å forstå mekanismene for nevrodegenerasjon.
Når vi ser tilbake på nevrovitenskapens historie, innser vi at de mest imponerende og banebrytende funnene aldri kunne ha skjedd uten direkte undersøkelse av den menneskelige hjerne. Gjennom tiden har kilden til hjernevev som skal studeres endret seg fra rå disseksjoner, tilfeldige “tilfeldige “tilfeldige møter” og i noen tilfeller ulovlig handel, til organiserte hjernesamlinger og strategiske moderne hjernebanker. Vurderingen av mange etiske aspekter er en av de viktigste faktorene som differensierer moderne hjernebanker fra fortidens hjernesamlinger. Den første virkelige moderne Brain Banks (BBs) ble innført ith andre halvdel av 1900-tallet. Nicholas Corsellis og Wallace Tourtelotte kan betraktes som pionerer innen moderne hjernebank. I Storbritannia samlet Corsellis en samling som holder over 1000 veldokumenterte hjerner påvirket av ulike psykiske og nevrologiske lidelser2. Videre bidro Corsellis til å avsløre behovet for å bevare friskt hjernevev i is på grunn av biokjemiske tester3. I mellomtiden i USA introduserte Wallace Tourtelotte antemortem hjernedonasjonsprogrammer for å lette oppfordringen til potensielle hjernedonorer og sikre at hjernene som samles inn, ledsages av en komplett medisinsk og nevrologisk historie4,5. For en historisk oversikt over hjernesamlinger og moderne BBs, se Carlos et al. 6.
Så hvorfor trenger vi fortsatt menneskelige hjerner? Hjernesykdommer kan bare gis en klar diagnose etter nevropatologisk undersøkelse. Nevropatologi utfordrer den kliniske diagnosen, og er nøkkelen til en korrekt tolkning av de kliniske symptomene og oppdagelsen av de histologiske basene til nye syndromiske varianter. Faktisk kan diagnosen omdefineres basert på det patologiske bildet. Likevel har obduksjonsraten gått ned de siste tiårene på grunn av nylig utvikling av innovative neuroimaging teknikker. Gjennom hjerneavbildning kan de morfologiske, funksjonelle og metabolske endringene i hjernen, samt omfanget av protein misfolding, vurderes in vivo. In vivo neuroimaging og andre biomarkørstudier kan imidlertid bare gi et “estimat” av det patologiske bildet, da de ikke klarer å oppdage subtile cellulære og molekylære endringer. Fremskritt innen molekylær avbildning og oppdagelsen av nye biomarkører, målmolekyler og tracers7 (f.eks. amyloid, TAU, mikrogliale sporstoffer) gjør den menneskelige hjernen enda mer uunnværlig for tolkning av data hentet fra kliniske evalueringer og biomarkørtesting. Videre omics teknologier (genomikk, epigenomi, transkripsjonsmikromikk, metabolomics, proteomics, lipidomics, etc.), utført på frisk og frossen hjernevev, åpnet opp nye muligheter for å forstå sykdomsmekanismer og oppdage risikogener, nye diagnostiske og prognostiske markører, og potensielle narkotika mål8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,,21,22,23.
For disse formålene arkiverer moderne BBs godt karakteriserte hjernevev av høy kvalitet, noe som gjør dem tilgjengelige for det vitenskapeligesamfunnet 3,24. Hjernene levert av BBs bør ledsages av en fullstendig klinisk historie. Aktiviteten til en BB inkluderer følgende: (1) Anerkjennelse og rekruttering av syke og friske individer til hjernedonasjonsprogrammer; den ideelle betingelsen ville være å oppnå en tverrfaglig oppfølging av givere gjennom hele livet for å oppnå en komplett klinisk, livsstil og sosial historie, og biomarkør profiler; faktisk, kognitiv reserve og hjernestruktur avhenger av livsstil og sosio-pedagogiskefaktorer 25,26, så denne informasjonen beriker de totale dataene for hånden. (2) Oppkjøp av hjernen (bestående av cerebrum, lillehjernen og hjernestammen) og relaterte vev (f.eks. ryggmarg, kranialnerver og ganglia osv.) etter donorens død, samtidig som standardiserte juridiske og etiske forskrifter overholdes. (3) Riktig behandling (disseksjon, fiksering, frysing) av hjernen, som definert i en standardisert operativ protokoll, for å oppnå høy kvalitet vev og for å tillate fremtidig bruk i tverrfaglig forskning. (4) Detaljert nevropatologisk karakterisering som gir en endelig bestemt diagnose. (5) Lagring og distribusjon av vevsmateriale til forskningsmiljøet27,,28.
Alle BBs lagrer både frosne og formalin-fast-parafin innebygd vev. Hver BB har sin egen protokoll. Bortsett fra spesielle studier, som den bihemisfæriske kutteprotokollen til Biomedical Research Institute (New Jersey)29 og Deramecourt’s studie av cerebrovaskulær patologi30,kuttet de største BBs i verden bare cerebrum, lillehjernen og hjernestammen langs midtlinjen (skyttenplan). Den ene halvdelen dissekeres frisk og deretter frosset for biokjemiske studier, mens den andre er fast i formalin for histopatologisk vurdering. Så utføres biokjemiske og histopatologiske analyser separat på hver halvkule. Beslutningen om hvilken side som er fast eller frosset (lateralitet), avhenger av entall bank31,32,33,34,35. Så mange nevrologiske sykdommer er asymmetriske, tilbyr vår BB en unik protokoll for kutting av friske hjerner: tilstøtende deler av hjernestammen og hver halvkule er vekselvis faste og frosne; et fast stykke på den ene halvkule tilsvarer en frossen på den andre halvkule. Gjennom denne metoden er bruk av hjernevev optimalisert, og en fullstendig histologisk karakterisering av alt frossent materiale kan oppnås med mulighet for å oppnå og sammenligne histologiske og biokjemiske opplysninger fra alle områder av begge halvkuler.
Rammen av vårt hjernebankprosjekt er byen Abbiategrasso. Abbiategrasso er en liten by ca 22 km sørvest for byen Milano, i Nord-Italia. Den har en befolkning på ca 32.600 mennesker. Det er hjem til Golgi-Cenci (GC) Foundation. GC Foundation er en del av et stort rehabiliterings geriatrisk sykehus (ASP Golgi-Redaelli), og er et institutt med fokus på forskning om aldring og eldreomsorg. Spesielt fokuserer det på å studere mental aldring, de sosiale og atferdsmessige faktorene som påvirker det, og biologien og patologien underliggende aldersavhengige nevrokognitive lidelser (NCDs). I 2009 lanserte GC Foundation en ny langsgående studie med 1321 deltakere (av 1644 kvalifiserte fag: innledende responsrate på 80,3 %) født mellom 1935 og 1939 (mellom 70 og 75 år), av kaukasisk etnisitet, som bor i det samme lille geografiske området. Studien ble kalt InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; på engelsk: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) og er for tiden pågående. InveCe.Ab er planlagt å få en kohort med maksimal homogenitet og minst variasjon for å vurdere forekomsten, forekomsten og naturlig historie med demens, sammen med mulige risiko- eller beskyttelsesfaktorer, inkludert atferdsmessige, psykososiale, kliniske og biologiske variabler36. Kohortens egenskaper er vist i figur 1 og tabell 1. De epidemiologiske dataene er i samsvar med demenstrenden i deneuropeiske befolkningen 37,,38 og InveCe.Ab-deltakerne har homogene genetiske og miljømessige egenskaper, noe som representerer en god modell for å studere banen fra normal aldring til nevrokognitive lidelser. Faktisk krever homogene populasjoner færre forsøkspersoner for å nå tilstrekkelig statistisk kraft. InveCe.Ab-metoden er allerede rapportert andresteder 36, men det er viktig å understreke sin flerdimensjonale tilnærming gjennom periodiske kontroller (hvert 2-3 år) ved hjelp av samme sett med evalueringer, inkludert: blodprøvetaking (metabolsk panel, homocystein og vitaminer, DNA-ekstraksjon for å profilere Apolipoprotein E (APOE) og andre genetiske polymorfimer relatert til kognisjon og aldring), antropometriske målinger (vekt, høyde og midje), Talking While Walking Test (dual task test), et intervju for å vurdere livsstil (Middelhavet diett overholdelse, nivåer av fysisk aktivitet og kognitivt engasjement) og sosiale faktorer (sosialt engasjement, ensomhet), en nevropsykologisk evaluering og en klinisk generell undersøkelse. Å sammenligne slike langsgående data med postmortem nevropatologiske data ville være avgjørende for forskning. Derfor unnfanget vårt team og spesielt Dr. Michela Mangieri den nevropatologiske tilnærmingen nevnt ovenfor. Siden 2014 og under den andre oppfølgingen ble InveCe.Ab-deltakerne bedt om å donere hjernen sin, og dermed føre til fødselen av Abbiategrasso Brain Bank (ABB). Kjernegiverne til ABB er InveCe.Ab-deltakerne, men ABB er nå åpen for andre frivillige givere. De er pasienter fra ASP Golgi-Redaelli, hjem til flere pasienter som er rammet av ulike nevrologiske sykdommer eller voksne frivillige som lærer om ABB-prosjektet og tilhører det samme geografiske området (Abbiategrasso og omgivelser). Alle givere gjennomgår samme evalueringsprotokoll.
Forfatterne foreslår en metode for å spore individuelle baner av normal aldring og mulig progresjon til NCDs, og å nøyaktig administrere, behandle og karakterisere hjerner ervervet fra slike givere fulgt langsgående. Videre er vårt mål å møte og engasjere enkeltpersoner i periodiske nevrologiske vurderinger, seminarer og pedagogiske aktiviteter om hjernens velvære og å øke deres bevissthet om hjernedonasjon til forskningsformål.
Kritiske trinn i protokollen
Vårt mål er å oppnå, karakterisere og lagre vev av god kvalitet som kommer fra med detaljert historie avledet fra langsgående observasjon. For å nå dette målet, er det nødvendig å håndtere følgende viktige aspekter. Som beskrevet ovenfor begynner protokollen med rekruttering av givere, som er det første avgjørende trinnet. Deretter er det nødvendig at giverne fortsetter oppfølgingsprogrammet og opprettholder vedheftet til prosjektet over tid til den faktiske donasjonen av hjernen. På dødstidspunktet er det nødvendig for ABB-ansatte å bli umiddelbart varslet for å innkalle obduksjonsteamet innen 24 timer, og er viktig for tilstrekkelig vevskvalitet. Fersk skjæring av hjernehalvkulene krever en jevn hånd og en bestemt trening. For å unngå cellulære skader forårsaket av langsom frysing og oppnå skiver av god kvalitet for kryostat og omics, er det viktig at de fryses raskt. Tatt i bruk hastigheten på penetrasjon av formalinløsning (1 mm/ time), for å bevare vevantigenisitet, holdes soakingtiden til enkeltskiven på sitt minimum.
Feilsøking av metoden
For å løse de kritiske trinnene nevnt ovenfor tilbyr vi følgende tilnærming. Donorrekruttering og overholdelse av oppfølging: Det er flere faktorer som hindrer hjernedonasjon, inkludert frykt for å skade kroppens figur, renhet og integritet, eller muligheten for å føle smerte etter døden. Noen bekymrer seg til og med for at obduksjonen kan utføres mens de fortsatt er ilive 70,71. Bekymringer om forstyrrelse av begravelse ordninger og økonomisk byrde er også til stede72. Videre kan et medisinsk personells mangel på kunnskap om postmortemprosedyrer og manglende evne til å ta opp bekymringene til potensielle givere eller deres nok fraråde registrering. Alle disse faktorene kan gi et lavt bevissthetsnivå med et lavt antall registrerte deltakere og en høy mulighet for donortap over tid. Faktisk bør rekrutteringsprogrammet for givere være effektivt for å spre bevissthet, skape tillit og overbevise folk om å registrere seg og opprettholde høye oppfølgingsdeltakelser. Etter vår erfaring gjøres dette gjennom nøye utvalg av potensielle givere og grundig forklaring av BB’s formål. Vi tilbyr pedagogiske aktiviteter og en empatisk tilnærming som tar for seg både friske menneskers frykt og behov og de som er rammet av nevrodegenerative sykdommer og deres familier. Vi finner at potensielle givere er mer sannsynlig å gi sitt samtykke når de nærmer seg personlig. En ansikt-til-ansikt tilnærming skaper et forhold basert på gjensidig tillit og respekt som er grunnleggende for å oppnå en høy prosentandel av registrering til hjernedonasjon og oppfølgingsvurderinger. En høyt utdannet stab med en sterk følelse av etikk først nærmer seg den potensielle donor, diskuterer muligheten for å donere hjernen etter døden, forklarer verdien av menneskelig hjernevev til nevrovitenskapelig forskning, og klargjør enhver tvil om postmortem prosedyrer. Gunstig jungeltelegrafen er like viktig. Etter hjernehøstingen gis passende oppmerksomhet og forsiktighet for å komponere på nytt. Det er viktig å vise respekt og takknemlighet til den avdøde ved å behandle forsiktig. Noen måneder etter skal et møte kommunisere resultatene av den nevropatologiske analysen når de blir bedt om av familiemedlemmer.
Dødstidspunktet og hjernehøsting: Når personen aksepterer, blir de donor og får et identifikasjonskort med et nummer for å kontakte 24 timer /dag, 7 dager /uke (mottaksnummeret til ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital som er koblet til oss). Videre er det gitt en klebende tag til de pårørende som skal brukes ved sykehusinnleggelse. Begravelsesbyråene i området ble tidligere informert om å bringe liket til ABB-anleggene, hvor obduksjonsteamet er innkalt. Obduksjonsteamet består av en patolog, en nevrolog og / eller en nevrobiolog, og en anatomisk romtekniker, som er på vakt fra 06:00 til 23:00 hver dag; noen trainee studenter er også ofte til stede for å hjelpe og ta bilder.
Presisjonen og konsistensen av de friske kutteprosedyrene sikres ved involvering av de samme to operatørene (en nevrolog og en patolog) som har utviklet metoden og har flere års erfaring innen nevropatologi. Når de fryser skivene, blir de satt på et prefrozen aluminiumsbrett og dekket med en forrigling aluminiumsplate for å holde dem godt flate. Umiddelbart etter blir de satt i flytende nitrogen i 3 minutter, før de oppbevarer dem ved -80 °C. Skivene som skal festes er individuelt innpakket i gasbind, og gjennomvåt i en 10% fosfat bufret formalinløsning, som erstattes etter en dag. Deretter holdes de i formali ikke mer enn 5 ekstra dager; Men med tanke på at formalinløsningen trenger inn på 1 mm / dag, ønsker vi å forkorte ytterligere soaking tid.
Begrensninger av metoden
Forskningsmetoden som er beskrevet her dekker bare et begrenset geografisk område, og personene som er involvert i donasjonsprogrammet har egenskaper som ikke representerer befolkningen helt. Selv om det er mer enn akseptabelt, kan et postmortemintervall opptil 24 timer gi endringer i noen proteinstrukturer, enzymer og RNA av hjernevev. Fastsettelsen av AFS og pH er kanskje ikke helt tilstrekkelig for å bestemme vevskvalitet73, og vi utvikler andre måter å autentisere vevskvalitet basert på RNA-integritet.
Når det gjelder mikrotomkuttprosedyren, selv om det er svært nyttig for å rekonstruere anatomiske relasjoner, bør det bemerkes at bruk av makroseksjoner ikke er enkel og presenterer noen tekniske vanskeligheter. Vår metode er utfordrende og tidkrevende. Kostnadene er ganske høye og finansiering er ikke alltid lett. Finansieringen kommer hovedsakelig fra offentlig (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) og private ressurser (Golgi-Cenci Foundation), private donasjoner, ideelle organisasjoner (f.eks. “Federazione Alzheimer Italia”) og gir deltakelse.
Betydningen av ABB-metoden med hensyn til eksisterende/alternative metoder
I begynnelsen målrettet vårt hjernedonasjonsprogram enkeltpersoner som deltar i InveCe.Ab-langsgående studie. Som en konsekvens er hjernen donert ledsaget av detaljert klinisk, biologisk og sosial informasjon samlet inn gjennom årene. Styrken til ABB stammer nettopp fra denne særegne opprinnelsen. Faktisk, studere en gruppe av sosialt og genetisk relaterte mennesker som deler biologiske egenskaper og miljøeksponeringer forbedrer statistisk analyse. Videre inkluderer studien følgende fordeler: 1) Ser etter og sørger for behovene til samfunnet (loven om å “gi før du spør”): folk får en gratis periodisk kontroll som fastlegen er informert, et telefonnummer til vår sekretær er gitt for konsultasjoner, og alvorlig funksjonshemmede mennesker besøkes hjemme; 2) Engasjerende deltakere, personer med offentlige roller og allmennleger i pedagogiske aktiviteter gjennom organisering av periodiske seminarer (knyttet til hjernens helse, hjernedonasjon og generell helse), og planlegging av tematiske kurs (f.eks. bruk av informasjonsteknologi enheter for eldre); 3) Møte folk og vedta en ansikt til ansikt tilnærming. Alle disse elementene utgjør styrken i ABB-prosjektet. Videre forbedrer prosjektet de kliniske evnene til involvert medisinsk personell, da de får erfaring i både antemortem vurderinger og postmortem nevropatologiske evalueringer. I denne forbindelse vil vi gjerne nevne den svært særegne opplevelsen av “The minority aging research study”. Denne studien involverte et begrenset og utvalgt antall afroamerikanere bosatt i Chicago-området (784 av 1357 kvalifiserte fag: responsrate på 57%). Deltakerne ble besøkt årlig hjemme og ble bedt om å bli med i hjernen donasjon programmet. Denne studien er basert på en uvanlig tilnærming med noen likheter med vår å få høye prosentandeler av positiv respons på hjernen donasjon programmet (352 givere av 784 deltakere ble registrert: 44%), om enn obduksjonsgraden var ikke helt tilfredsstillende (53%)74. Akkurat som i “The minority aging research study”, tilbyr vi pedagogiske aktiviteter og en empatisk tilnærming, og oppnår gode resultater. Spesielt er vår svarprosent 93%, registreringsprosenten er 28,7%, og obduksjonshastigheten for øyeblikket er 67%. Disse prisene viser at prosjekter som direkte engasjerer folk har en mer betydelig prosentandel av donasjoner. Andre hjernedonasjonsprogrammer, med mindre oppmerksomhet til å bygge et forhold med potensielle givere, har generelt en lav registreringsprosent, som er rundt 10-15% eller mindre73,,75.
Det er få tidligere kohortstudier som slutter med en nevropatologisk analyse. Videre er flertallet av hjernebanker og repositorier sykdomsditorier sykdomsditorier, og det er en knapphet på “kontroll” hjerner fra friske givere sammenlignet med antall “syke” hjerner. Bare et begrenset antall BB er basert på befolkningsstudier som involverer både syke og normale forsøkspersoner for å studerealdringsbaner 73,74,,76,,77,,78,,79,,80., Noen studier som “The minority aging research study” i USA74 og “The Vantaa 85+ studien” i Finland76 ligner vår, men de har en tendens til å løpe ut med avslutningen av kohorten. I stedet er ABBs donasjonsprogram tenkt å fortsette i lang tid i fremtiden, verve potensielle givere og planlegge oppfølginger selv etter slutten av InveCe.Ab longitudinal studien. Denne tilnærmingen gjør vår rekrutteringsmetode lik den av “Sun Health Research Institute (SHRI) hjernedonasjon program” som er rettet mot et pensjonistsamfunn73. SHRI-protokollen for hjernedonasjon er svært effektiv med det korteste gjennomsnittlige postmortemintervallet i verden (3,92 timer). I likhet med de største BBs i verden, SHRI protokollen bare kutte cerebrum, lillehjernen og hjernestammen i midtlinjen (skytten plan), deretter den ene halvdelen er dissekert frisk og frosset for biokjemiske studier, mens den andre er løst i formalin for histopatologisk vurdering. En av styrkene til SHRI-disseksjonsprotokollen er imidlertid fiksering av individuelle skiver i stedet for hele halvkule. Faktisk er fiksering av en halvkule som helhet ikke optimal, på grunn av de forskjellige fikseringsgradientene mellom overflaten og kjernen. Videre kan de kortikale proteinene påvirkes av langvarig eksponering for formalinløsningen. Dermed grunnen til at vi bestemte oss for å fikse individuelle skiver.
Beslutningen om hvilken side som er fast eller frosset, avhenger av entallsbanken (alltid den samme, tilfeldig tildelt eller tildelt avhengig av om dagen for disseksjon er oddetall eller jevn)31,32,33,34,35. Så utføres biokjemisk og histopatologisk analyse separat på hver halvkule. Så mange nevrologiske sykdommer er asymmetriske, tilbyr vår BB en unik protokoll for å kutte ferske prøver: alternative seksjoner fra hjernestammen og fra hver halvkule av lillehjernen og cerebrum beholdes som fast eller frosset materiale; et fast stykke på den ene halvkule tilsvarer en frossen på den andre halvkule. Vår metode gir mulighet til å oppnå en fullstendig histologisk karakterisering av alt frosset materiale og å sammenligne resultatene fra alle områder av begge sider. Som sagt i innledningen, metoden beskrevet tillater oss å få så mye informasjon som mulig fra hjernevevet. Videre gir ABB-metoden en grunnleggende, men fullstendig nevropatologisk karakterisering, inkludert nesten alle kjente hjerneproteinopatier og vaskulær patologi. På grunn av den kontroversielle rollen vaskulære skader i å bestemme kognitiv svekkelse, bestemte vi oss for å bruke en dobbel scoring for vaskulærbyrde 30,53.
Som forklart i protokollen, bruker vi en tverrfaglig tilnærming. Selv om dette er en tidkrevende og arbeidstært metode, mener vi det gir flere fordeler for forskning. For eksempel, i et tidligere arbeid, viste vi at høy tHcy per se, eller MTHFR C677T TT forbundet med APOE-ε4 allele, kan være relatert til utøvende dysfunksjoner i stedet for hukommelsestap81. Derfor kan det være interessant å evaluere forsøkspersoner med denne spesielle genetiske profilen på nevropatologisk nivå. Dette er et eksempel på hvordan en slik grundig oppfølging er nyttig for å skape nye forskningshypoteser som kan etterprøves gjennom utredning av biologisk materiale samlet inn i banken vår. En annen demonstrasjon av fordelen med vår tilnærming er inkludering av QEEG blant vurderingene vi rutinemessig utfører, for sin originalitet og den relative brukervennligheten. Faktisk oppdager EEG den synaptiske aktiviteten til hjernebarken ved å registrere de elektriske potensialet til dendritter som tilhører kortikale pyramidale nevroner82. QEEG kan betraktes som en biomarkør for estimering av kortikal synaptisk aktivitet som er relatert til kognisjon83. Spesielt har en reduksjon i alfarytmer i den bakre delen av hjernen med en generell økning av lavere frekvenser (theta- og deltarytmer) vært relatert til kortikal forbindelsessammenbrudd. Det bør vurderes at de fleste av de diagnostiske korrelasjonsstudiene har vært basert på en klinisk diagnose som bare er en sannsynlig og ikke en bestemtdiagnose 84,,85,,86,,87. Bare svært få målrettede studier har sammenlignet QEEG-data med det nevropatologiske bildet for å undersøke sammenhengen mellom QEEG- og LTS-varianter88,,89og skillet mellom FTLD og AD83. Ved å avslutte vår studie med en definisjon av nevropatologisk diagnose, er det da mulig å tolke observasjonene som er gjort på den cerebrale elektriske aktiviteten på riktig måte. Videre utfører seriell QEEG i hvert emne kan vi spore intra-individuelle EEG bølger bane og deres korrelasjoner med det nevropatologiske bildet. Etter individuelle modifikasjoner av kortikal elektrisk aktivitet over tid kan føre til en bedre forståelse av sin betydning som en biomarkør for begynnende demens.
Fremtidige applikasjoner og retning av metoden
Implementering av vevsfordelingen er et av våre viktigste potensielle mål. For å gjøre dette, vi har nettopp etablert en vitenskapelig kommisjon inkludert direktør for GC Foundation (geriatrician), en akademiker av nevrologi fra Universitetet i Pavia, en nevrolog og en patolog både fra GC Foundation & Geriatric Hospital ASP Golgi-Redaelli. Når du distribuerer hjernevev, histologiske lysbilder og andre biologiske prøver, er det viktig å huske at givere ble enige om donasjonen for forskningens skyld. Fordelingen av materiale bør derfor skje forsvarlig, akkurat som beskrevet i BNE Code of Conduct40. Enhver part som sender inn en forespørsel om materiale, skal angi typen og mengden av utvalget som trengs, gi en beskrivelse av forskningsprosjektet og hvordan prøvene skal brukes, og når det er mulig, levere bevis på tidligere publikasjoner (for overføringsavtalen, se figur 9). Hjernebanken fungerer ikke for økonomisk vinning. Så, avgifter betalt av forskere bør bare dekke utgifter til vev anskaffelse, behandling, lagring og distribusjon.
Planer om å begynne å analysere tilfeller med eksomsekvensering og Omics teknikker, som proteomics og transkripsjonsmikromikk, er i bevegelse. Vår alternative prøvetakingsmetodikk vil tillate omics studier som skal utføres på histologisk veldefinerte vev fra begge halvkuler. Gjennom denne tilnærmingen vil det være mulig å sammenligne mønsteret av genaktivering i forskjellige hjerneområder på samme halvkule og i de tilsvarende områdene på den andre halvkule, og kunne korrelere genaktivering med histopatologi. På dette feltet vil dype læringsprogrammer være av stor interesse, inkludert datastyrt analyse av histologiske lysbilder og banebrytende korrelasjon av kliniske, histologiske og omics data. Andre sammenhenger mellom mange forskjellige variabler kan identifiseres så vel som andre mulige teknologiske anvendelser. Tilgjengeligheten av frosset materiale fra begge halvkuler vil tillate en nøyaktig topografi av genaktivering og proteindistribusjon. Dette vil være av spesiell interesse selv hos friske, med tanke på at både hjernefunksjoner og noen sykdommer er asymmetriske.
Videre kan vi få cellekulturer fra velemerte hjernedonorer. Faktisk leverer cellekulturer fra leptomeningene av høstede hjerner levende celler som kan brukes til videre undersøkelse av sykdom eller aldringsmekanismer, ved hjelp av den induserte pluripotente stamceller (iPSCs) teknologi som innebærer omprogrammering av leptomeningeal fibroblaster og differensiere dem i nevrale celler i avansertemodeller 90.
Som hjernens alder kan forskjellige profiler av endring forekomme på molekylært, cellulært og vevsnivå. Hver hjerne er unik. Hver har sin egen måte å reagere på interne og eksterne stressfaktorer; noen motstår mens andre bukker under og viser forskjellige patologier. Uoverensstemmelser mellom den kliniske presentasjonen og det nevropatologiske bildet eksisterer ofte fordi topografien av lesjonene, i stedet for deres molekylære natur, bestemmer den kliniske presentasjonen. Den riktige og bestemte diagnosen kan bare oppnås ved å kombinere det kliniske syndromet med nevropatologiske funn som ofte legger til viktige etiologiske ledetråder som er nødvendige for å løse patogenesen av sykdommene. I Europa er det et forsøk på å skape en standard tilnærming til nevropatologisk diagnose. Vår diagnostiske protokoll følger nesten helt de nylig publiserte retningslinjene for nevropatologisk diagnose for hjernebank91. Dette vil tillate oss å samle og dele godt dokumentert hjernevev, med det potensielle målet om å etablere den første italienske Brain Bank. Faktisk, i Italia er det hjernerepositorier, men ikke hjernebanker basert på kohortstudier. Vårt mål er å utvikle en metode for hjernevevhøsting som kan implementeres bredt over hele Italia, for å etablere et nettverk som bruker en felles protokoll og deler sammenlignbart materiale. For å gjøre det, involvering av andre forskningssentre og etableringen av et bestemt nettsted er blant hovedmålene for fremtiden.
Innovative teknologier blir stadig brukt til analyse av molekylær natur nevrodegenerative sykdommer og for biomarkøridentifikasjon. I denne sammenheng vil det være et økende behov for hjerner ledsaget av informasjon om kognitive og aldrende baner oppnådd gjennom langsgående studier, med vekt på viktigheten av en nevropatologisk verifisert epidemiologisk tilnærming92.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å vie dette arbeidet til Dr.ssa Michela Mangieri. Før hun døde for tidlig, unnfanget hun og startet Abbiategrasso Brain Bank Project.
Vi er takknemlige overfor våre hjernedonorer, som sjenerøst bidrar til forskning som donerer kroppens edleste organ; uten dem denne forskningen ville ikke være mulig.
Vi er takknemlige til Valeria Marzagalli for hennes dyrebare arbeid i ABB-prosjektet.
Forfatterne takker prof. Johannes Attems, Dr. Paolo Fociani og Dr. Giorgio Giaccone for deres dyrebare veiledning og kloke råd.
Vi vil gjerne takke Dr.ssa Alice Cirrincione og Miss Giulia Bortone for deres dyrebare hjelp gjennom hele prosjektet.
Mange takker fru Tere Cassani for hennes støtte og til “Federazione Alzheimer Italia” for samarbeidet.
Forfatterne er takknemlige til Dr. Matteo Moretti og prof. Antonio Marco Maria Osculati, Institutt for folkehelse, eksperimentell og rettsmedisin, Universitetet i Pavia.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |