Este protocolo describe un método para rastrear trayectorias individuales de envejecimiento cerebral a través de un programa de donación cerebral y caracterización adecuada de cerebros. Los donantes cerebrales participan en un estudio longitudinal a largo plazo que incluye evaluaciones multidimensionales en serie. El protocolo contiene una descripción detallada del procesamiento cerebral y una metodología de diagnóstico precisa.
En una población en constante envejecimiento, se espera que aumente la prevalencia de trastornos neurodegenerativos. Comprender los mecanismos de la enfermedad es la clave para encontrar medidas preventivas y curativas. La forma más eficaz de lograr esto es a través del examen directo del tejido cerebral enfermo y sano. Los autores presentan un protocolo para obtener, procesar, caracterizar y almacenar tejido cerebral de buena calidad donado por individuos registrados en un programa de donación cerebral antemortem. El programa de donación incluye un enfoque empático cara a cara para las personas, una colección de información clínica, biológica, social y de estilo de vida complementaria y evaluaciones multidimensionales en serie a lo largo del tiempo para realizar un seguimiento de las trayectorias individuales del envejecimiento normal y el deterioro cognitivo. Dado que muchas enfermedades neurológicas son asimétricas, nuestro banco cerebral ofrece un protocolo único para cortar especímenes frescos. Las secciones cerebrales de ambos hemisferios se congelan alternativamente (a -80 oC) o se fijan en formalina; una rebanada fija en un hemisferio corresponde a una congelada en el otro hemisferio. Con este enfoque, se puede obtener una caracterización histológica completa de todo el material congelado, y se pueden realizar estudios de omics sobre tejidos histológicamente bien definidos de ambos hemisferios, ofreciendo así una evaluación más completa de los mecanismos de la enfermedad neurodegenerativa. El diagnóstico correcto y definitivo de estas enfermedades sólo puede lograrse combinando el síndrome clínico con la evaluación neuropatológica, que a menudo añade importantes pistas etiológicas necesarias para interpretar la patogénesis. Este método puede llevar mucho tiempo, ser costoso y limitado, ya que sólo cubre un área geográfica limitada. Independientemente de sus limitaciones, el alto grado de caracterización que proporciona puede ser gratificante. Nuestro objetivo final es establecer el primer Banco Cerebral Italiano, al mismo tiempo que enfatizamos la importancia de los estudios epidemiológicos neuropatológicamente verificados.
Según la OMS, aproximadamente 50 millones de personas padecen demencia, una cifra que se prevé triplicar para 2050. La enfermedad de Alzheimer es la principal causa de demencia, seguida de la enfermedad cerebrovascular y otros trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad. En 2017, la OMS elaboró el Observatorio Mundial de la Demencia para sensibilizar sobre la demencia y fomentar un plan de acción mundial contra ella1. Cada individuo tiene su propia trayectoria de envejecimiento cerebral, por lo tanto, la búsqueda de la cura puede ser difícil debido a la complejidad de la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas. Tal vez, cada persona posee su propia patogénesis escrita en el tejido cerebral que requiere un enfoque personalizado. Por lo tanto, el estudio del tejido cerebral será la clave para entender los mecanismos de la neurodegeneración.
Mirando hacia atrás en la historia de la neurociencia, nos damos cuenta de que los descubrimientos más impresionantes y rompedores nunca podrían haber ocurrido sin el examen directo del cerebro humano. A lo largo del tiempo, la fuente de tejido cerebral a estudiar ha cambiado de disecciones brutas, “encuentros casuales” aleatorios y, en algunos casos, comercio ilegal, a colecciones de cerebros organizadas y bancos cerebrales modernos estratégicos. La consideración de muchos aspectos éticos es uno de los principales factores que diferencian a los bancos cerebrales modernos de las colecciones cerebrales del pasado. Los primeros brain Banks (BBs) modernos reales se instituyeron en la segunda mitad delsiglo XX. Nicholas Corsellis y Wallace Tourtelotte pueden ser considerados pioneros de la banca cerebral moderna. En el Reino Unido, Corsellis reunió una colección con más de 1000 cerebros bien documentados afectados con diversos trastornos mentales y neurológicos2. Además, Corsellis ayudó a revelar la necesidad de preservar el tejido cerebral fresco en hielo en aras de las pruebas bioquímicas3. Mientras tanto, en los EE.UU., Wallace Tourtelotte introdujo programas de donación de cerebros antemortem para facilitar la solicitud de posibles donantes cerebrales y asegurarse de que los cerebros recogidos están acompañados de una historia médica y neurológica completa4,5. Para obtener una visión general histórica de las colecciones de cerebros y los BB modernos, véase Carlos et al. 6.
Entonces, ¿por qué todavía necesitamos cerebro humano? Las enfermedades cerebrales sólo pueden ser dadas un diagnóstico definitivo después de un examen neuropatológico. La neuropatología desafía el diagnóstico clínico, y es la clave para una correcta interpretación de los síntomas clínicos y para el descubrimiento de las bases histológicas de nuevas variantes sindrómicas. De hecho, el diagnóstico se puede redefinir en función del panorama patológico. No obstante, la tasa de autopsias ha disminuido en las últimas décadas debido al reciente desarrollo de técnicas innovadoras de neuroimagen. A través de imágenes cerebrales, las alteraciones morfológicas, funcionales y metabólicas en el cerebro, así como la extensión de la desdolicización de proteínas, se pueden valorar in vivo. Sin embargo, la neuroimagen in vivo y otros estudios de biomarcadores sólo pueden dar una “estimación” de la imagen patológica, ya que son incapaces de detectar cambios celulares y moleculares sutiles. Los avances en la imagen molecular y el descubrimiento de nuevos biomarcadores, moléculas diana y trazadores7 (por ejemplo, amiloide, TAU, trazadores microgliales) hacen que el cerebro humano sea aún más indispensable para la interpretación de los datos obtenidos a partir de evaluaciones clínicas y pruebas de biomarcadores. Además, las tecnologías omicas (genómica, epigenómica, transcriptómica, metabolómica, proteómica, Lipidomics, etc.), realizado en tejido cerebral fresco y congelado, abrió nuevas posibilidades para comprender los mecanismos de la enfermedad y descubrir genes de riesgo, nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico, y posibles objetivos farmacológicos8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,,21,22,2 .
Para estos fines, los BB modernos archivan tejidos cerebrales bien caracterizados y de alta calidad que los hacen disponibles para la comunidad científica3,,24. Los cerebros suministrados por los BB deben ir acompañados de una historia clínica completa. La actividad de un BB incluye lo siguiente: (1) Reconocimiento y reclutamiento de individuos enfermos y sanos a programas de donación cerebral; la condición ideal sería lograr un seguimiento multidisciplinario de los donantes a lo largo de la vida para obtener una historia clínica, de estilo de vida y social completa, y perfiles de biomarcadores; de hecho, la reserva cognitiva y la estructura cerebral dependen del estilo de vida y de los factores socioeducativas25,,26, por lo que esta información enriquece los datos totales en cuestión. (2) Adquisición del cerebro (compuesto por cerebrum, cerebelo y tallo cerebral) y tejidos relacionados (por ejemplo, médula espinal, nervios craneales y ganglios, etc.) siguiendo la desaparición del donante, respetando al mismo tiempo las regulaciones legales y éticas estandarizadas. (3) Procesamiento adecuado (disección, fijación, congelación) del cerebro, tal como se define en un protocolo operativo estandarizado, para obtener tejido de alta calidad y para permitir su uso futuro en la investigación multidisciplinaria. (4) Caracterización neuropatológica detallada que proporciona un diagnóstico definitivo final. (5) Almacenamiento y distribución de material tisular a la comunidad de investigación27,28.
Todos los BBs almacenan tejidos incrustados congelados y de formalina fija-parafina. Cada BB tiene su propio protocolo. Excepto para estudios particulares, como el protocolo de corte bihemisférico del Instituto de Investigación Biomédica (Nueva Jersey)29 y el estudio de Deramecourt de la patología cerebrovascular30, los BBs más grandes del mundo simplemente cortan el cerebro, el cerebelo y el cerebro a lo largo de la línea media (plano sagital). Una mitad se disecciona fresca y luego se congela para estudios bioquímicos, mientras que la otra se fija en formalina para la evaluación histopatológica. Por lo tanto, los análisis bioquímicos e histopatológicos se realizan por separado en cada hemisferio. La decisión sobre qué lado está fijo o congelado (lateralidad), depende del banco singular31,32,33,34,35. Como muchas enfermedades neurológicas son asimétricas, nuestra BB ofrece un protocolo único para cortar cerebros frescos: secciones adyacentes del tronco encefálico y cada hemisferio están alternativamente fijos y congelados; una rebanada fija en un hemisferio corresponde a una congelada en el otro hemisferio. A través de este método, se optimiza el uso del tejido cerebral, y se puede lograr una caracterización histológica completa de todo el material congelado con la posibilidad de obtener y comparar información histológica y bioquímica de todas las áreas de ambos hemisferios.
El marco de nuestro proyecto de banco cerebral es la ciudad de Abbiategrasso. Abbiategrasso es una pequeña ciudad a unos 22 km al suroeste de la ciudad de Milán, en el norte de Italia. Tiene una población de unas 32.600 personas. Es el hogar de la Fundación Golgi-Cenci (GC). LA Fundación GC forma parte de un gran Hospital Geriátrico de Rehabilitación (ASP Golgi-Redaelli), y es un instituto que se centra en la investigación sobre el envejecimiento y el cuidado de los ancianos. En particular, se centra en el estudio del envejecimiento mental, los factores sociales y conductuales que influyen en él, y la biología y la patología subyacentes a los trastornos neurocognitivos dependientes de la edad (ENT). En 2009, la Fundación GC lanzó un nuevo estudio longitudinal con 1321 participantes (de 1644 sujetos elegibles: tasa de respuesta inicial del 80,3%) nacido entre 1935 y 1939 (de entre 70 y 75 años), de etnia caucásica, viviendo en la misma pequeña área geográfica. El estudio se llamó InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; en inglés: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) y actualmente está en curso. InveCe.Ab está previsto obtener una cohorte con la máxima homogeneidad y menor variabilidad con el fin de evaluar la incidencia, prevalencia e historia natural de la demencia, junto con sus posibles factores de riesgo o protección, incluyendo variables conductuales, psicosociales, clínicas y biológicas36. Las características de la cohorte se muestran en la Figura 1 y la Tabla 1. Los datos epidemiológicos son coherentes con la tendencia de la demencia en la población europea37,,38 y los participantes de InveCe.Ab tienen características genéticas y ambientales homogéneas, lo que representa un buen modelo para estudiar la trayectoria desde el envejecimiento normal hasta los trastornos neurocognitivos. De hecho, las poblaciones homogéneas requieren menos sujetos para alcanzar un poder estadístico adecuado. La metodología InveCe.Ab ya se ha notificado en otroslugares 36, pero es importante subrayar su enfoque multidimensional a través de controles periódicos (cada 2-3 años) utilizando el mismo conjunto de evaluaciones, incluyendo: muestreo de sangre (panel metabólico, homocisteína y vitaminas, extracción de ADN para perfilar la Apolipoproteína E (APOE) y otros polimorfismos genéticos relacionados con la cognición y el envejecimiento), mediciones antropométricas (peso, altura y cintura), Talking While Walking Test (prueba de doble tarea), una entrevista para evaluar el estilo de vida (adherencia a la dieta mediterránea, niveles de actividad física y compromiso cognitivo) y factores sociales (implicación social, soledad), una evaluación neuropsicológica y un examen clínico general. Comparar estos datos longitudinales con datos neuropatológicos postmortem sería crucial para la investigación. Por lo tanto, nuestro equipo y particularmente la Dra. Michela Mangieri concibieron el enfoque neuropatológico mencionado anteriormente. Desde 2014 y durante el segundo seguimiento, se pidió a los participantes de InveCe.Ab que donaran sus cerebros, y dando así lugar al nacimiento del Abbiategrasso Brain Bank (ABB). Los principales donantes de ABB son los participantes de InveCe.Ab, pero ABB ahora está abierto a otros donantes voluntarios. Son pacientes de ASP Golgi-Redaelli, hogar de varios pacientes afectados por diferentes enfermedades neurológicas o voluntarios adultos que aprenden sobre el Proyecto ABB y pertenecen a la misma zona geográfica (Abbiategrasso y alrededores). Todos los donantes se someten al mismo protocolo de evaluación.
Los autores proponen un método para rastrear trayectorias individuales del envejecimiento normal y la posible progresión a las ENT, y para gestionar, procesar y caracterizar con precisión los cerebros adquiridos de dichos donantes seguidos longitudinalmente. Además, nuestro objetivo es conocer e involucrar a las personas en evaluaciones neurológicas periódicas, seminarios y actividades educativas con respecto al bienestar del cerebro y aumentar su conciencia de la donación de cerebros con fines de investigación.
Pasos críticos en el protocolo
Nuestro objetivo es obtener, caracterizar y almacenar tejidos de buena calidad procedentes de sujetos con una historia detallada derivada de la observación longitudinal. Para alcanzar este objetivo, es necesario abordar los siguientes aspectos clave. Como se describió anteriormente, el protocolo comienza con el reclutamiento de donantes, que es el primer paso crucial. Entonces, es necesario que los donantes continúen el programa de seguimiento y mantengan la adhesión al proyecto a lo largo del tiempo hasta la donación real del cerebro. En el momento de la muerte, es necesario que el personal de la ABB sea notificado rápidamente para convocar al equipo de autopsia dentro de las 24 horas, siendo importante para la calidad adecuada del tejido. El corte fresco de los hemisferios cerebrales requiere una mano firme y un entrenamiento específico. Para evitar el daño celular causado por la congelación lenta y obtener rebanadas de buena calidad para el criostato y la omica, es importante que se congelen rápidamente. Teniendo en cuenta la velocidad de penetración de la solución de formalina (1 mm/hora), para preservar la antigenicidad tisular, el tiempo de remojo de la rebanada única se mantiene en su mínimo.
Solución de problemas del método
Con el fin de abordar los pasos críticos mencionados anteriormente, ofrecemos el siguiente enfoque. Reclutamiento de donantes y adherencia a los seguimientos: Hay varios factores que dificultan la donación de cerebros, incluyendo el temor de dañar la figura del cuerpo, pureza e integridad, o de la posibilidad de sentir dolor después de la muerte. Algunos incluso se preocupan de que la autopsia se puede llevar a cabo mientras que todavía están vivos70,,71. Las preocupaciones sobre la interrupción de los arreglos funerarios y la carga financiera también están presentes72. Además, la falta de conocimiento del personal médico sobre los procedimientos postmortem y la incapacidad para abordar las preocupaciones de los posibles donantes o de su NOK pueden desalentar el registro. Todos estos factores pueden producir un bajo nivel de conciencia con un bajo número de participantes inscritos y una alta posibilidad de pérdida del donante con el tiempo. De hecho, el programa de reclutamiento de donantes debería ser eficiente para difundir la concienciación, inculcar confianza y convencer a las personas para que registren y mantengan altas tasas de participación en el seguimiento. En nuestra experiencia, esto se hace a través de una cuidadosa selección de posibles donantes y una explicación exhaustiva de los propósitos del BB. Ofrecemos actividades educativas y un enfoque empático que aborda los miedos y necesidades tanto de las personas sanas como de las personas afectadas por enfermedades neurodegenerativas y sus familias. Encontramos que los donantes potenciales son más propensos a dar su consentimiento cuando se les acerca en persona. Un enfoque cara a cara crea una relación basada en la confianza mutua y el respeto que es fundamental para lograr un alto porcentaje de registro en la donación de cerebros y evaluaciones de seguimiento. Un personal altamente capacitado con un fuerte sentido de la ética primero se acerca al donante potencial, discute la posibilidad de donar el cerebro después de la muerte, explica el valor del tejido cerebral humano para la investigación neurocientífica, y aclara cualquier duda con respecto a los procedimientos postmortem. El boca a boca favorable es igualmente importante. Después de la cosecha del cerebro, se da la atención y el cuidado adecuados para recomponer el cadáver. Es importante mostrar respeto y gratitud a la persona fallecida tratando el cadáver suavemente. Unos meses después, está programada una reunión para comunicar los resultados del análisis neuropatológico cuando lo soliciten los familiares.
La hora de la muerte y la recolección del cerebro: Cuando la persona acepta, se convierte en donante y se le da una tarjeta de identificación con un número para contactar 24 horas/día, 7 días/semana (el número de recepción del Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli que está conectado con nosotros). Además, se da una etiqueta adhesiva a los familiares que se utilizarán en caso de hospitalización. Las agencias funerarias de la zona fueron previamente informadas para llevar el cuerpo a las instalaciones de la ABB, donde se convoca al equipo de autopsias. El equipo de autopsia está compuesto por un patólogo, un neurólogo y/o un neurobiólogo, y un técnico de sala anatómica, que están de guardia de 6 a. m. a 11 p. m. todos los días; algunos estudiantes en prácticas también están presentes con frecuencia para ayudar y tomar fotos.
La precisión y consistencia de los nuevos procedimientos de corte están garantizadas por la participación de los mismos dos operadores (un neurólogo y un patólogo) que han desarrollado el método y tienen varios años de experiencia en neuropatología. Al congelar las rodajas, se colocan en una bandeja de aluminio precongelado y se cubren con una placa de aluminio entrelazado para mantenerlas bien planas. Inmediatamente después, se ponen en nitrógeno líquido durante 3 minutos, antes de almacenarlos a -80 oC. Las rodajas a fijar se envuelven individualmente en gasa y se empapan en una solución de formalina tamponada de 10%, que se sustituye después de un día. Posteriormente, se mantienen en formalina no más de 5 días adicionales; sin embargo, teniendo en cuenta que la solución de formalina penetra a 1 mm/día, nos gustaría acortar aún más el tiempo de remojo.
Limitaciones del método
El método de investigación descrito aquí sólo cubre un área geográfica limitada, y las personas involucradas en el programa de donación poseen características que no representan completamente a la población general. Aunque es más que aceptable, un intervalo postmortem de hasta 24 horas puede producir alteraciones en algunas estructuras proteicas, enzimas y ARN del tejido cerebral. La determinación de AFS y pH puede no ser totalmente adecuada para determinar la calidad del tejido73 y estamos desarrollando otras formas de autenticar la calidad del tejido en función de la integridad del ARN.
En cuanto al procedimiento de corte de microtomos, aunque muy útil para la reconstrucción de relaciones anatómicas, cabe señalar que el uso de macrosecciones no es sencillo y presenta algunas dificultades técnicas. Nuestro método es desafiante y requiere mucho tiempo. Los costos son bastante altos y la financiación no siempre es fácil. La financiación proviene principalmente de recursos públicos (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) y privados (Fundación Golgi-Cenci), donaciones privadas, organizaciones sin fines de lucro (por ejemplo, “Federazione Alzheimer Italia”) y otorga la participación.
La importancia del método ABB con respecto a los métodos existentes/alternativos
Al principio, nuestro programa de donación de cerebros se dirigió a individuos que participaban en el estudio longitudinal InveCe.Ab. Como consecuencia, los cerebros donados van acompañados de información clínica, biológica y social detallada recopilada a lo largo de los años. La fuerza de ABB deriva precisamente de este origen distintivo. De hecho, estudiar un grupo de personas relacionadas social y genéticamente que comparten características biológicas y exposiciones ambientales mejora el análisis estadístico. Además, el estudio incluye los siguientes beneficios: 1) Cuidar y proveer para las necesidades de la comunidad (el acto de “dar antes de preguntar”): las personas reciben un chequeo periódico gratuito del cual se informa al médico general, se proporciona un número de teléfono de nuestro secretario para consultas y se visita a las personas severamente discapacitadas en casa; 2) Involucrar a los participantes, las personas con funciones públicas y los médicos generales en las actividades educativas a través de la organización de seminarios periódicos (relacionados con la salud cerebral, la donación de cerebros y la salud general), y la planificación de cursos temáticos (por ejemplo, el uso de dispositivos de tecnología de la información para personas mayores); 3) Conocer a las personas y adoptar un enfoque cara a cara. Todos estos elementos constituyen la fuerza del proyecto ABB. Además, el proyecto mejora las capacidades clínicas del personal médico involucrado, ya que adquieren experiencia tanto en evaluaciones antemortem como en evaluaciones neuropatológicas postmortem. En este sentido, nos gustaría mencionar la experiencia muy peculiar de “El estudio de investigación de envejecimiento minoritario”. Este estudio involucró un número limitado y seleccionado de afroamericanos que residen en el área de Chicago (784 de 1.357 sujetos elegibles: tasa de respuesta del 57%). Los participantes fueron visitados anualmente en casa y se les pidió que se unieran al programa de donación cerebral. Este estudio se basa en un enfoque inusual con algunas similitudes con la nuestra obteniendo altos porcentajes de respuesta positiva al programa de donación cerebral (352 donantes de 784 participantes fueron inscritos: 44%), aunque la tasa de autopsia no fue del todo satisfactoria (53%)74. Al igual que en “El estudio de investigación de envejecimiento minoritario”, ofrecemos actividades educativas y un enfoque empático, logrando excelentes resultados. En particular, nuestra tasa de respuesta es del 93%, el porcentaje de inscripción es del 28,7%, y la tasa de autopsia en este momento es del 67%. Estas tasas muestran que los proyectos que involucran directamente a las personas tienen un porcentaje más sustancial de donaciones. Otros programas de donación de cerebros, con menos atención en la construcción de una relación con donantes potenciales, generalmente tienen un bajo porcentaje de inscripción, siendo alrededor de 10-15% o menos73,,75.
Hay pocos estudios previos de cohortes que terminan con un análisis neuropatológico. Además, la mayoría de los bancos y repositorios cerebrales están centrados en enfermedades y hay una escasez de cerebros de “control” de donantes sanos en comparación con el número de cerebros “enfermos”. Sólo un número limitado de BBs se basan en estudios poblacionales que involucran tanto sujetos enfermos como normales para estudiar trayectorias de envejecimiento73,,74,,76,,77,,78,,79,,80. Algunos estudios como “El estudio de investigación de envejecimiento minoritario” en los EE.UU.74 y “El estudio Vantaa 85+” en Finlandia76 son similares a los nuestros, pero tienden a agotarse con la terminación de la cohorte. En su lugar, el programa de donación de ABB está previsto que continúe durante mucho tiempo en el futuro, alistando a posibles donantes y programando seguimientos incluso después del final del estudio longitudinal InveCe.Ab. Este enfoque hace que nuestro método de reclutamiento sea similar al del programa de donación cerebral del “Sun Health Research Institute (SHRI)” que está dirigido a una comunidad de jubilados73. El protocolo SHRI para la donación de cerebros es muy eficiente con el intervalo postmortem medio más corto del mundo (3,92 horas). Al igual que los BB más grandes del mundo, el protocolo SHRI simplemente corta el cerebrum, el cerebelo y el tronco encefálico en la línea media (plano sagital), entonces una mitad se disecciona fresca y congelada para estudios bioquímicos, mientras que la otra se fija en formalina para la evaluación histopatológica. Sin embargo, uno de los puntos fuertes del protocolo de disección SHRI es la fijación de rebanadas individuales en lugar de todo el hemisferio. De hecho, fijar un hemisferio como un todo no es óptimo, debido a los diferentes gradientes de fijación entre la superficie y el núcleo. Además, las proteínas corticales pueden verse afectadas por una exposición prolongada a la solución de formalina. Por lo tanto, la razón por la que decidimos arreglar rebanadas individuales.
La decisión sobre qué lado es fijo o congelado, depende del banco singular (siempre el mismo, asignado aleatoriamente o asignado dependiendo de si el día de la disección es impar o par)31,32,33,34,35. Por lo tanto, el análisis bioquímico e histopatológico se lleva a cabo por separado en cada hemisferio. Como muchas enfermedades neurológicas son asimétricas, nuestra BB ofrece un protocolo único para cortar muestras frescas: secciones alternativas del tronco encefálico y de cada hemisferio de cerebelo y cerebrum se conservan como material fijo o congelado; una rebanada fija en un hemisferio corresponde a una congelada en el otro hemisferio. Nuestro método da la oportunidad de obtener una caracterización histológica completa de todo el material congelado y comparar los resultados de todas las áreas de ambos lados. Como se dijo en la introducción, el método descrito nos permite obtener tanta información como sea posible del tejido cerebral. Además, el método de ABB produce una caracterización neuropatológica básica pero completa, incluyendo casi todas las proteinopatías cerebrales conocidas y patología vascular. Debido al controvertido papel de las lesiones vasculares en la determinación del deterioro cognitivo, decidimos utilizar una doble puntuación para la carga vascular30,,53.
Como se explica en el protocolo, utilizamos un enfoque multidisciplinario. Aunque este es un método lento y laborioso, creemos que proporciona varias ventajas para la investigación. Por ejemplo, en un trabajo anterior, demostramos que el alto tHcy per se, o MTHFR C677T TT asociado con el alelo APOE-4, puede estar relacionado con disfunciones ejecutivas en lugar de pérdida de memoria81. Por lo tanto, puede ser interesante evaluar sujetos con este perfil genético particular a nivel neuropatológico. Este es un ejemplo de cómo un seguimiento tan profundo es útil para crear nuevas hipótesis de investigación verificables a través de la investigación del material biológico recogido en nuestro banco. Otra demostración de la ventaja de nuestro enfoque es la inclusión de QEEG entre las evaluaciones que realizamos habitualmente, por su originalidad y la relativa facilidad de uso. De hecho, el EEG detecta la actividad sináptica de la corteza cerebral registrando los potenciales eléctricos de las dendritas pertenecientes a las neuronas piramidales corticales82. QEEG puede considerarse un biomarcador para la estimación de la actividad sináptica cortical relacionada con la cognición83. Particularmente, una disminución en los ritmos alfa en la parte posterior del cerebro con un aumento general de frecuencias más bajas (ritmos theta y delta) se ha relacionado con la ruptura de la conexión cortical. Se debe considerar que la mayoría de los estudios de correlación diagnóstica se han basado en un diagnóstico clínico que es sólo un diagnóstico probable y no definitivo84,85,86,87. Sólo muy pocos estudios dirigidos han comparado los datos de QEEG con el cuadro neuropatológico para investigar la correlación entre las variantes88, 89,89y LA distinción entre FTLD y AD83. Al finalizar nuestro estudio con una definición del diagnóstico neuropatológico, es posible interpretar correctamente las observaciones realizadas sobre la actividad eléctrica cerebral. Además, realizando QEEG serie en cada sujeto podemos rastrear la trayectoria de las ondas EEG intra-individuales y sus correlaciones con el cuadro neuropatológico. Después de las modificaciones individuales de la actividad eléctrica cortical a lo largo del tiempo puede conducir a una mejor comprensión de su significado como un biomarcador para la demencia incipiente.
Aplicaciones futuras y dirección del método
La implementación de la distribución de tejidos es uno de nuestros principales objetivos prospectivos. Para ello, acabamos de crear una comisión científica que incluye al director de la Fundación GC (geriatra), académico de Neurología de la Universidad de Pavía, neurólogo y patólogo tanto de la Fundación GC como del Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli. Al distribuir tejido cerebral, diapositivas histológicas y otras muestras biológicas, es importante recordar que los donantes estuvieron de acuerdo con la donación en aras de la investigación. Por lo tanto, la distribución del material debe llevarse a cabo con prudencia, tal como se describe en el Código de Conducta40de la BNE. Cualquier parte que presente una solicitud de material debe indicar el tipo y la cantidad de la muestra necesaria, proporcionar una descripción del proyecto de investigación y cómo se utilizarán las muestras y, siempre que sea posible, proporcionar pruebas de publicaciones anteriores (para el acuerdo de transferencia, véase la figura 9). El banco cerebral no funciona para obtener ganancias financieras. Por lo tanto, las tasas pagadas por los investigadores sólo deben cubrir los gastos de la adquisición, procesamiento, almacenamiento y distribución de tejidos.
Los planes para comenzar a analizar casos con técnicas de secuenciación de exomas y omics, como la proteómica y la transcriptómica, están en movimiento. Nuestra metodología de muestreo alternativo permitirá realizar estudios omics en tejidos histológicamente bien definidos de ambos hemisferios. A través de este enfoque, será posible comparar el patrón de activación genética en diferentes áreas cerebrales del mismo hemisferio y en las áreas correspondientes del otro hemisferio, y ser capaz de correlacionar la activación genética con la histopatología. En este campo, las aplicaciones de aprendizaje profundo serían de gran interés, incluyendo el análisis informatizado de diapositivas histológicas y la correlación de vanguardia de datos clínicos, histológicos y omicos. Se pueden identificar otras correlaciones entre muchas variables diferentes, así como otras posibles aplicaciones tecnológicas. La disponibilidad de material congelado de ambos hemisferios permitirá una topografía precisa de la activación genética y la distribución de proteínas. Esto será de particular interés incluso en sujetos sanos, teniendo en cuenta que tanto las funciones cerebrales como algunas enfermedades son asimétricas.
Además, podemos obtener cultivos celulares de donantes cerebrales bien caracterizados. De hecho, los cultivos celulares a partir de los leptomeninges de los cerebros cosechados suministran células vivas que pueden utilizarse para una mayor investigación de enfermedades o mecanismos de envejecimiento, mediante la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que consiste en reprogramar fibroblastos leptomeningales y diferenciarlos en células neuronales en los modelos avanzados90.
A medida que el cerebro envejece, diferentes perfiles de cambio pueden ocurrir a nivel molecular, celular y tisular. Cada cerebro es único. Cada uno tiene su propia manera de responder a los factores de estrés internos y externos; algunos se resisten mientras que otros sucumben y muestran patologías distintas. Las discrepancias entre la presentación clínica y el cuadro neuropatológico a menudo existen porque la topografía de las lesiones, en lugar de su naturaleza molecular, determina la presentación clínica. El diagnóstico correcto y definitivo sólo podría lograrse combinando el síndrome clínico con los hallazgos neuropatológicos que a menudo añaden importantes pistas etiológicas necesarias para desentrañar la patogénesis de las enfermedades. En Europa, hay un esfuerzo por crear un enfoque estándar para el diagnóstico neuropatológico. Nuestro protocolo de diagnóstico sigue casi por completo las directrices recientemente publicadas sobre el diagnóstico neuropatológico para la banca cerebral91. Esto nos permitirá recoger y compartir tejido cerebral bien documentado, con el objetivo prospectivo de establecer el primer Banco Cerebral Italiano. De hecho, en Italia hay repositorios cerebrales pero no bancos cerebrales basados en estudios de cohortes. Nuestro objetivo es desarrollar un método para la recolección de tejido cerebral que se puede implementar ampliamente en toda Italia, para establecer una red que utilice un protocolo común y comparta material comparable. Para ello, la implicación de otros centros de investigación y la creación de un sitio web específico son algunos de los principales objetivos para el futuro.
Las tecnologías innovadoras se utilizan constantemente para el análisis de la naturaleza molecular de las enfermedades neurodegenerativas y para la identificación de biomarcadores. En este contexto, habrá una creciente necesidad de cerebros acompañada de información sobre trayectorias cognitivas y de envejecimiento obtenida a través de estudios longitudinales, haciendo hincapié en la importancia de un enfoque epidemiológico neuropatológicamente verificado92.
The authors have nothing to disclose.
Queremos dedicar este trabajo a la Dra. ssa Michela Mangieri. Antes de morir prematuramente, concibió e inició el Proyecto Abbiategrasso Brain Bank.
Estamos agradecidos a nuestros donantes cerebrales, que están contribuyendo generosamente a la investigación donando el órgano más noble de su cuerpo; sin ellos esta investigación no sería posible.
Agradecemos a Valeria Marzagalli su preciado trabajo en el proyecto ABB.
Los autores agradecen al Prof. Johannes Attems, al Dr. Paolo Fociani y al Dr. Giorgio Giaccone su valiosa orientación y sabio consejo.
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Alice Cirrincione y a la señorita Giulia Bortone por su valiosa ayuda a lo largo del proyecto.
Muchas gracias a la Sra. Tere Cassani por su apoyo y a la “Federazione Alzheimer Italia” por su colaboración.
Los autores agradecen al Dr. Matteo Moretti y al Prof. Antonio Marco Maria Osculati, Departamento de Salud Pública, Medicina Experimental y Forense de la Universidad de Pavía.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |