Этот протокол предоставляет исследователям быстрый, косвенный метод измерения TLR-зависимых NF-Ap-1 транскрипционный фактор активности в линии макрофаговой линии murine макрофагов в ответ на различные полимерные поверхности и адсорированные белковые слои, которые моделируют микросреду биоматериального имплантата.
Стойкий воспалительный ответ хозяина на имплантированный биоматериал, известный как реакция инородного тела, является серьезной проблемой в разработке и внедрении биомедицинских устройств и конструкций тканевой инженерии. Макрофаги, врожденная иммунная клетка, являются ключевыми игроками в реакции инородного тела, потому что они остаются на месте имплантата в течение всего срока службы устройства, и обычно изучаются, чтобы получить понимание этого вредного ответа хозяина. Многие исследователи биоматериалов показали, что адсорбированные белковые слои на имплантированных материалах влияют на поведение макрофагов, а затем влияют на реакцию хозяина. Методы в этой работе описывают модель in vitro с использованием адсорбовых белковых слоев, содержащих молекулы клеточного повреждения на полимерных биоматериальных поверхностях для оценки реакций макрофагов. Репортер NF/AP-1 репортер макрофаг-клеток линии и связанных с ним колориметрической щелочной фосфатазы анализа были использованы в качестве быстрого метода для косвенного изучения NF-ЗБ /AP-1 транскрипции фактор активности в ответ на сложные адсорbed белковых слоев, содержащих белки крови и повреждения связанных молекулярных моделей, как модель комплексного адсора белка.
Реакция инородного тела (FBR) является хронической реакцией хозяина, которая может негативно повлиять на производительность имплантированного материала или устройства (например, устройства доставки лекарств, биосенсоров), через постоянное высвобождение воспалительных посредников и препятствуя интеграции между имплантированным материалом и окружающим веществом1. Этот врожденный иммунный ответ инициируется процедурой имплантации и характеризуется долгосрочным наличием врожденных иммунных клеток и образованием волокнистой капсулы вокруг имплантата1. В контексте ответов на материалы хоста взаимодействия макрофагов-материалов оказывают значительное влияние на прогрессирование реакции хозяина и развитие FBR1. Макрофаги представляют собой разнообразную популяцию врожденных иммунных клеток, набираемую в место имплантации либо из популяций макрофагов, проживающих в тканях, либо из крови в качестве макрофагов, полученных из моноцитов. Они начинают накапливаться в месте имплантации вскоре после имплантации, и в течение нескольких дней становятся преобладающей популяцией клеток в микросреде имплантата. Макрофаги, придерживающиеся материалов, наряду с инородными клетками-гигантами тела (FBGC), образующиеся в результате синтеза макрофагов, могут сохраняться на поверхности материка в течение всего срока службы имплантата2,3. Следовательно, макрофаги считаются ключевыми игроками в ответ ениму теле из-за их роли оркестровки характерные шаги FBR: острый воспалительный ответ, ремоделирование тканей, и формирование фиброзной ткани1.
Платные рецепторы (TLRs) являются семейством рецепторов распознавания образов, которые выражаются многими иммунными клетками, включая макрофаги, и, как было показано, играют значительную роль в воспалении и заживлении ран. В дополнение к патогенных лигандов, TLRs способны связывать эндогенные молекулы, известные как повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPs), которые высвобождаются во время некроза клеток и активировать воспалительные сигнальные пути в результате производства провоспалительных цитокинов4. Мы и другие предложили, что ущерб, понесенный во время процедур биоматерии мягких тканей релиз DAMPs, которые затем адсорб на биоматериальные поверхности в дополнение к белкам крови и модулировать последующие клеточные материалы взаимодействия5,6. Когда макрофаги взаимодействуют с адсорбированным слоем белка на имплантате, их поверхность TLRs может распознавать адсорбированные DAMPs и активировать провоспалительные сигнальные каскады, что приводит к активации фактора транскрипции NF-З и AP-1 и выработке провоспалительных цитокинов. Ранее мы показали, что макрофаги минина значительно увеличили активность NF-QB/AP-1 и фактор некроза опухоли (TNF-з, провоспалительных цитокинов) секреции в ответ на DAMP-содержащих адсорбированных белков ы слоев на различных полимерных поверхностей по сравнению с поверхностями с адсорбированных сыворотки или плазмы только (т.е., нет DAMPs настоящее время), и что этот ответ в значительной степени опосредовано TLR2, в то время как TLR4 играет меньшую роль5.
NF-ЗБ / AP-1 репортер макрофаг клеточной линии(Таблица материалов), используемый в этом протоколе является удобным методом для измерения относительной активности NF-ЗБ и AP-1 в макрофагах5,7,8. В сочетании с ингибиторами Пути TLR, эта клеточная линия является полезным инструментом для исследования активации TLR и его роль в воспалении в ответ на различные стимулы5,7,8. Клетки репортера являются модифицированной мышью макрофагов-подобной клеточной линии, которая может застойно производить секретную эмбриональную щелочнуюфосфатазу (SEAP) на NF-ЗБ и AP-1 активации транскрипционного фактора 9. Анализ колориметрической эзамиатической щелочной фосфатазы(Таблица материалов)может быть использован для количественной оценки относительных количеств экспрессии SEAP в качестве косвенного измерения активности NF–ЗБ/AP-1. Поскольку NF-КВ и AP-1 находятся ниже по течению многих клеточных сигнальных путей, нейтрализация антител и ингибиторов, нацеленных на конкретные TLRs (например, TLR2) или молекулы адаптера TLR (например, MyD88), могут быть использованы для проверки роли конкретного пути. Методология, описанная в этой статье, обеспечивает простой и быстрый подход для оценки вклада TLR сигнализации в реакции murine macrophage на различные полимерные поверхности с адсорбированными слоями белка, содержащими как белки крови, так и DAMPs в качестве модели в ипруто имплантированных биоматериалов.
Основным направлением нашей лаборатории является реакция хозяина на имплантаты твердых биоматериалов мягких тканей, и, в частности, как повреждение клеток, понесенное во время процедуры имплантации, влияет на реакцию хозяина. Представленная здесь работа описывает предварительные эк?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы с благодарностью признают оперативное финансирование со стороны Канадских институтов здравоохранения исследовательский проект (PTJ 162251), Королевский университет Сената Консультативный комитет по исследованиям и инфраструктурной поддержки со стороны Канадского фонда инноваций Джон Эван лидерство фонда (проект 34137) и Министерство исследований и инноваций Онтарио научно-исследовательский фонд (проект 34137). L.A.M. была поддержана Королевским университетом Р. Сэмюэлем Маклафлином, Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канадской премии канадской стипендии и стипендией Онтарио. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Мирона Шевчука за его щедрый дар репортера NF-ЗБ/AP-1, а также докторов Майкла Бленнерхассетта и Сандры Лоуренссен за использование их системы гельной визуализации и считывателя пластин.
Cell culture reagents | |||
anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
Kits and assays | |||
ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
Polymeric coating reagents | |||
Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
Consumables | |||
Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 |