高分子表面上の吸着タンパク質層におけるトール様受容体媒介NF-kB/AP-1シグナル伝達を調べるマクロファージレポーター細胞アッセイ
Summary
このプロトコルは、生体材料インプラント微小環境をモデル化する様々なポリマー表面および吸着タンパク質層に応答して、マウスマクロファージ細胞株におけるTLR依存性NF-аb/AP-1転写因子活性を測定する迅速かつ間接的な方法を研究者に提供する。
Abstract
異物反応として知られる移植された生体材料に対する持続的な炎症宿主応答は、生物医学デバイスおよび組織工学構造の開発および実施において重要な課題である。先天性免疫細胞であるマクロファージは、装置の寿命にわたってインプラント部位にとどまるため、異物反応の主要なプレーヤーであり、この有害な宿主応答の理解を得るために一般的に研究されている。多くのバイオマテリアル研究者は、移植された材料に吸着したタンパク質層がマクロファージの挙動に影響を与え、その後宿主の応答に影響を与えることを示しています。本論文の方法では、ポリマー生体材料表面上の細胞損傷分子を含む吸着タンパク質層を用いたインビトロモデルを用いてマクロファージ応答を評価する。NF-аB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株および関連する比色アルカリホスファターゼアッセイは、体内の生物材料表面に形成された複雑な吸着タンパク質層のモデルとして、血液タンパク質および損傷関連分子パターンを含む複雑な吸着タンパク質層に応答してNF-аB/AP-1転写因子活性を間接的に調べる迅速な方法として使用された。
Introduction
異物反応(FBR)は、移植された物質または装置(例えば、薬物送達装置、バイオセンサー)の性能に悪影響を及ぼし得る慢性宿主応答であり、炎症メディエーターの持続的放出を通じて、および移植された物質と周囲組織1との間の統合を妨げることによって。この自然免疫応答は、移植手順によって開始され、インプラント1の周りに先天性免疫細胞および線維性カプセル形成の長期存在によって特徴付けられる。物質ホスト応答の文脈の中で、マクロファージ材料相互作用は、ホスト応答の進行およびFBR1の開発に大きな影響を与える。マクロファージは、多様な自然免疫細胞集団であり、組織常駐マクロファージ集団または単球由来マクロファージとして血液のいずれかからインプラント部位にリクルートされる。彼らは移植直後にインプラント部位に蓄積し始め、数日以内にインプラント微小環境における主要な細胞集団となる。材料接着マクロファージは、マクロファージ融合によって形成される異物巨細胞(FBGC)とともに、インプラント2、3の寿命にわたって材料表面で持続し得る。その結果、マクロファージは、FBRの特徴的なステップを調整する役割に起因する異物反応の主要なプレーヤーであると考えられる:急性炎症反応、組織改造、および線維組織の形成1。
トール様受容体(TR)は、マクロファージを含む多くの免疫細胞によって発現されるパターン認識受容体のファミリーであり、炎症および創傷治癒において重要な役割を果たすることが示されている。病原体由来のリガンドに加えて、TRは、細胞壊死中に放出される損傷関連分子パターン(DamP)として知られる内因性分子に結合し、炎症性サイトカイン4の産生をもたらす炎症性シグナル伝達経路を活性化することができる。我々および他の人は、軟組織生物質注入手順中に生じた損傷が、血液タンパク質に加えて生体材料表面に吸着し、その後の細胞と物質間相互作用を調節する、Dammpを放出することを提案している。マクロファージがインプラント上の吸着タンパク質層と相互作用すると、その表面TRは吸着したDRPを認識し、炎症性シグナル伝達カスケードを活性化し、NF-κBおよびAP-1転写因子活性化および炎症性サイトカインの産生につながる。我々は、マウスマクロファージがNF-κB/AP-1活性および腫瘍壊死因子α(TNF-α、 炎症性サイトカイン)は、吸着血清または血漿のみ(すなわち、DMPが存在しない)の表面と比較して様々なポリマー表面上のDAMP含有吸着タンパク質層に応答して、かつこの応答がTLR2によって主に媒介されることを、TLR4はより少ない役割を果たしている5。
このプロトコルで使用されるNF-κB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株(材料表)は、マクロファージ5、7、8における相対的なNF-κBおよびAP-1活性を測定するための便利な方法である。TLR経路阻害剤と組み合わせて、この細胞株は、様々な刺激5、7、8に応答して炎症におけるTLR活性化およびその役割を調べるのに有用なツールである。レポーター細胞は、NF-κBおよびAP-1転写因子活性化9に際して分泌胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)を安定的に産生することができる改変マウスマクロファージ様細胞株である。比色酵素アルカリホスファターゼアッセイ(材料表)は、NF-κB/AP-1活性の間接尺度としてSEAP発現の相対量を定量するために使用することができる。NF-κBおよびAP−1は多くの細胞シグナル伝達経路の下流にあるように、特定のTLR(例えば、TLR2)またはTLRアダプタ分子(例えば、MyD88)を標的とする中和抗体および阻害剤は、特定の経路の役割を検証するために使用することができる。この記事で説明する方法論は、移植されたバイオマテリアルのインビトロモデルとして、血液タンパク質とDMPの両方を含む吸着タンパク質層を有する様々なポリマー表面に対するマウスマクロファージ応答におけるTLRシグナル伝達の寄与を評価するための簡単かつ迅速なアプローチを提供する。
Protocol
1. 媒体および試薬の準備 線維芽細胞性媒体を調製する。ダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)、胎児ウシ血清(FBS)の50mL、ペニシリン/ストレプトマイシン5mLを合わせます。4 °Cで最大3ヶ月間保管してください。 レポーターマクロファージ成長媒体を50mLアリコートで調製する。DMEMの45 mL、FBSの5 mL、5 μg/mLマイコプラズマ除去試薬(材料表)、および200μg/mLフレオマイシン…
Representative Results
ポリマー被覆面の洗浄方法を試験し、コーティングの中断がないことを確認した。PMMA被覆顕微鏡スライドを70%エタノールに1時間浸漬してPMMAコーティング(図2、左パネル)を除去することが分かり、80重量%エタノール13におけるPMMAの溶解度に起因する可能性が高く、従ってPMMA被覆面を30分間のUV殺菌だけで洗浄した。コーティング?…
Discussion
私たちの研究室の主な焦点は、固体生体軟組織インプラントに対する宿主応答であり、特に移植手順中に生じた細胞損傷が宿主応答にどのような影響を与えるかである。ここで提示する研究は、レポーターマクロファージ細胞株とインビトロ生成DAMP含有細胞リサートを用いた予備実験について説明し、細胞損傷中に放出される分子の影響(すなわち、インプラント手術から)が生体材料に対す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、カナダ保健研究プロジェクト(PTJ 162251)、クイーンズ大学上院諮問委員会、カナダイノベーション財団ジョン・エヴァンのリーダーシップ基金(プロジェクト34137)および研究革新オンタリオ研究基金(プロジェクト34137)からのインフラ支援からの運営資金を感謝して認めています。L.A.M.は、クイーンズ大学R.サミュエル・マクラフリン・フェローシップ、カナダカナダ大学院奨学金修士賞、オンタリオ州大学院奨学金の自然科学・工学研究評議会の支援を受けました。著者たちは、NF-κB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株とマイケル・ブレナーハセット博士とサンドラ・ロウレンセン博士のゲルイメージングシステムとプレートプレートの使用に対する寛大な贈り物に対するマイロン・シェフツク博士に感謝したいと思います。
Materials
| Cell culture reagents | |||
| anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
| Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
| NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
| Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
| RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
| Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| Kits and assays | |||
| ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
| Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
| LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
| Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
| Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
| QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
| Polymeric coating reagents | |||
| Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
| Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
| Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
| Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
| Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
| Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
| Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
| Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
| Consumables | |||
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
| Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
| Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
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Cite This Article
McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).