球状外生长作为前维沃分析分析涉及的路径的表皮上皮细胞激活
Summary
本文介绍了一种培养和分析从小鼠肾脏分离出的封装球状上皮细胞生长的方法。此方法可用于研究涉及单骨上皮细胞增殖和迁移的途径。
Abstract
表皮上皮细胞（PEC）活化是影响球菌硬化发育和进展的关键因素之一。因此，抑制参与表皮上皮细胞活化的通路可能是减轻肾上腺疾病进展的工具。本文介绍了一种培养和分析从小鼠肾脏分离出的封装球状细胞生长的方法。解剖分离的小鼠肾脏后，组织被切碎，通过分离分离球蛋白。采集包皮球蛋白，培养单个球蛋白6天，获得肾上皮细胞的球状生长。在此期间，可以通过确定外显细胞的细胞数量或表面积来分析表皮上皮细胞增殖和迁移。因此，这种测定可以作为一种工具，用于研究转基因或敲敲小鼠基因表达的改变，或培养条件对表皮上皮细胞生长特性和信号的影响。使用这种方法，可以研究涉及表皮上皮细胞活化过程以及因此在球蛋白硬化过程中的重要通路。
Introduction
肾球疾病是肾病的重要群体，是最终期肾病（ESRD）的一个根本原因。不幸的是，具体的治疗选择是有限的，进展到ESRD是不可避免的。球状疾病由球状损伤的存在定义，可分组在炎症和非炎症性疾病中。虽然最初的侮辱是不同的，最近的研究表明，一个共同的细胞机制导致球状上皮细胞增生，并最终导致所有球状疾病的球状硬化症，无论根本原因1，2，3，4。2,3,41
具体来说，它表明，球状硬化病变主要由活化的表皮上皮细胞5，6,组成。在生理条件下，表皮上皮细胞是平的静态上皮细胞，与鲍曼的球状胶囊一起。然而，任何由于基因突变（如足细胞特异性或线粒体细胞病变）、炎症或超滤（例如，由肾质量降低、高血压、肥胖或糖尿病肌酸引起的肾球菌损伤）都可能引发表皮上皮细胞的激活。活性的表皮上皮细胞增殖并沉积细胞外基质，导致细胞新月或,硬化病变5、7、87的形成。5这些过程的进展导致肾功能丧失9。因此，在炎症和非炎症性球菌疾病1、2、3、4、10中，皮皮上皮细胞活化是球,2,3,菌硬化的发育和进展的关键因素。
分子过程调解表皮上皮细胞活化仍然在很大程度上未知。最近的研究表明，激活的皮皮上皮细胞d novo快递CD44，一种受体，是重要的激活参与细胞增殖和迁移的不同途径。此外，CD44的抑制作用被证明能抑制表皮上皮细胞活化，并减轻炎症和非炎症性球菌病动物模型中新月形成和球状硬化的进展。,12
由于单体上皮细胞活化是发展球状硬化和新月形成的关键技术，抑制这些细胞可以减缓球状疾病的进展。促进单体上皮细胞活化的分子通路的阐释可能导致特定治疗干预措施的发展，减少球状疾病中超塑料和球状硬化病变的形成。
在实验动物模型中，通常很难提供证据，证明基因表达的改变（淘汰模型或转基因小鼠模型）或药物治疗对表皮上皮细胞的直接影响。在传统的敲出小鼠中，观察到的体内变化可以通过皮皮上皮细胞的直接变化来解释。然而，由于基因表达在小鼠中的其他细胞类型中也发生了变化，因此不能排除由其他细胞类型调解的间接效应。由主要活跃在表皮上皮细胞中的启动子驱动的有条件的 cre-lox 小鼠的发展，在某些情况下提供了一个解决方案。然而，有条件的转基因模型是复杂的，虽然有更多的条件线可用，对于许多传统的淘汰或转基因小鼠线，还没有一个有条件的替代品。
为了研究对单体上皮细胞的直接影响，我们组开发了一种前体外测定，使用从小鼠肾脏分离出的单封装球蛋白来测量和分析表皮上皮细胞增殖和迁移。此方法将使我们能够确定单皮上皮细胞特异性效应，并找到负责任的途径，为单皮上皮细胞激活和测试治疗选项，以抑制这种激活。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用本文中描述的协议，可以使用单封装的球状细胞来评估单体上皮细胞增殖，这是单体上皮细胞激活的结果。这个外活体模型将使我们能够详细研究分子通路，其中涉及表皮上皮细胞活化。所述方法依靠肾脏解剖和分离的简单概念来分离和培养封装的球蛋白，并比较不同实验条件下皮皮上皮细胞的增殖和/或迁移。在培养中6天后可以分析的结果是，例如，生长的表面积或直径，或单个帽状球蛋?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了荷兰肾脏基金会（赠款14A3D104）和荷兰科学研究组织（NWO VIDI赠款：016.156.363）的支持。
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
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