上頭頂皮細胞活性化に関与する経路を解析するエクスビボアッセイとしての糸球体成長
Summary
本稿では、マウス腎臓から分離されたカプセル化糸球体上皮細胞の増殖を培養し、分析する方法について述べている。この方法は、頭頂皮細胞の増殖および移動に関与する経路を研究するために使用することができる。
Abstract
上頭頂皮細胞(PEC)活性化は、糸球体性動脈硬化症の発症および進行に関与する重要な因子の1つである。したがって、頭頂皮細胞活性化に関与する経路の阻害は、糸球体疾患の進行を減衰させるツールとなり得る。本稿では、マウス腎臓から分離されたカプセル化糸状糸球体の頭頂皮細胞の増殖を培養および分析する方法について述べている。単離マウス腎臓を解剖した後、組織をミンチ化し、糸球体をふるいにかけて単離する。カプセル化糸球体が採取され、単糸球体を6日間培養し、頭頂頭細胞の糸球体伸長を得る。この期間中、頭頂頭上皮細胞の増殖および移動は、細胞数または成長細胞の表面積を決定することによって分析することができる。したがって、このアッセイは、トランスジェニックマウスまたはノックアウトマウスにおける遺伝子発現の変化の影響、または頭頂皮細胞の成長特性およびシグナル伝達に対する培養条件の影響を研究するためのツールとして使用することができる。この方法を用いて、頭頂頭上皮細胞活性化の過程に関与する重要な経路、そして結果的に糸球体性動脈硬化症において重要な経路が検討できる。
Introduction
糸球体疾患は腎臓障害の重要なグループであり、末期腎疾患(ESRD)の主要な原因を表す。残念ながら、特定の治療オプションは限られており、ESRDへの進行は避けられません。糸球体疾患は、糸球体損傷の存在によって定義され、炎症性および非炎症性疾患でグループ化することができる。最初の侮辱は異なるが、最近の研究では、一般的な細胞機構が糸球体上皮細胞,過形成につながり、最終的には基底原因1、2、3、42に関係なく、すべての糸球体疾患における糸球体性動脈1硬化症につながることが示されている。3,4
具体的には、糸球体硬化性病変が活性化頭頂細胞5,6,6から主に構成されていることを示した。生理学的条件下では、頭頂上皮細胞は、糸球体のボウマンのカプセルに並ぶ平らな静止上皮細胞である。しかし、遺伝子変異(例えば、ポドサイト特異的またはミトコンドリア細胞症)、炎症または過濾過(例えば、腎質量の低下、高血圧、肥満または糖尿病性髄膜)による任意の糸球体損傷は、頭頂上皮細胞の活性化を引き起こす可能性がある。活性化された頭頂皮細胞は細胞外基質を増殖および沈着させ、細胞内三日月または硬化性病変の形成を生じる,5、7、8。87これらのプロセスの進行は腎機能9の損失をもたらす。したがって、頭頂皮細胞活性化は、炎症性および非炎症性糸球,体疾患1、2、3、4、102,の両方における糸球体性硬化症の発症および進行における重要な要因1である。4,103
頭頂上皮細胞の活性化を媒介する分子プロセスは、まだほとんど知られていない。最近の研究では、細胞増殖および移動に関与する異なる経路の活性化に重要な受容体である、ノボ発現CD44を活性化した頭頂頭細胞がCD44を発現することが示されている。さらに、CD44の阻害は、炎症性の動物モデルならびに非炎症性糸球体疾患11,12における三日形成および糸球硬化症の進行を抑制し、12上頭頂皮細胞の活性化を阻害することが示された。
頭頂上皮細胞活性化は糸球体性硬化症および三日月形成の発展のための重要なプレーヤーであるため、これらの細胞の阻害は糸球体疾患の進行を遅らせることができる。頭頂頭細胞活性化を促進する分子経路の解明は、糸球体疾患における過形成および糸球体硬化性病変の形成を減衰させる特定の治療介入の開発につながる可能性がある。
実験動物モデルでは、遺伝子発現の変化(ノックアウトモデルまたはトランスジェニックマウスモデル)や頭頂皮細胞に対する薬物治療の直接的な効果の証拠を提供することはしばしば困難である。従来のノックアウトマウスでは、生体内変化が観察され、頭頂皮細胞の直接的な変化によって説明され得る。しかし、遺伝子発現はマウス内の他の細胞型でも変化するため、他の細胞型によって媒介される間接的な効果を排除することはできません。主に頭頂頭上皮細胞で活性なプロモーターによって駆動される条件付き cre-lox マウスの開発は、場合によっては13の解決策を提供している。それにもかかわらず、条件付きトランスジェニックモデルは複雑であり、より多くの条件線が利用可能になるが、従来のノックアウトまたはトランスジェニックマウスラインの多くにとって、まだ条件付き代替手段はない。
頭頂頭細胞に対する直接的な影響を研究するために、我々のグループは、マウス腎臓から単一のカプセル化糸球体を用いて、頭頂皮細胞の増殖と移動を測定および分析するex vivoアッセイを開発した。この方法により、頭頂頭上皮細胞特異的な効果を決定し、頭頂頭上皮細胞活性化のための責任ある経路を見つけ、この活性化を阻害する治療選択肢をテストすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿で説明したプロトコルを用いて、単一のカプセル化糸球体を用いて、頭頂頭上皮細胞の増殖を評価することができる。このex vivoモデルは、頭頂皮細胞活性化に関与する分子経路を詳細に研究することを可能にする。記載された方法は、腎臓解剖およびふるい分けの単純な概念に依存して、糸球体を単離および培養し、異なる実験条件下での頭頂皮細胞の増殖および/または移動を比較す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、オランダ腎臓財団(助成金14A3D104)とオランダ科学研究機構(NWO VIDI助成金:016.156.363)によって支援されました。
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
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