एनईएमओ के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का उत्पादन, क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण
Summary
हम एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा एनओएमओ के आईकेके-बाइंडिंग डोमेन के संरचना निर्धारण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। तरीकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के साथ-साथ सफल क्रिस्टल अनुकूलन और प्रोटीन के संरचना निर्धारण के लिए रणनीतियां शामिल हैं।
Abstract
NEMO एक मचान प्रोटीन है जो किनेस IKKα और IKKο के साथ IKK-परिसर कोडांतरण द्वारा एनएफ-बी मार्ग में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। सक्रियण पर, आईकेके कॉम्प्लेक्स फॉस्फोरेलेट्स IFB अणुओं को एनएफ-बी परमाणु स्थानांतरण और लक्ष्य जीन की सक्रियता के लिए अग्रणी बनाता है। निमो/आईकेके इंटरैक्शन का अवरोध एनएफ-बी पाथवे गतिविधि के मॉड्यूलेशन के लिए एक आकर्षक चिकित्सीय प्रतिमान है, जिससे निमो अवरोधक डिजाइन और खोज के लिए एक लक्ष्य बन गया है । निमो अवरोधकों की खोज और अनुकूलन की प्रक्रिया को सुगम बनाने के लिए, हमने निमो के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का एक बेहतर निर्माण इंजीनियर किया जो एपीओ रूप में प्रोटीन के संरचना निर्धारण के लिए अनुमति देगा और छोटे आणविक वजन अवरोधकों से बंधे। यहां, हम निमो के आईकेके-बाइंडिंग डोमेन के डिजाइन, अभिव्यक्ति और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए उपयोग की गई रणनीति प्रस्तुत करते हैं। प्रोटीन ई. कोलाई कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जो डेन्टुरिंग स्थितियों के तहत घुलनशील होता है और तीन क्रोमेटोग्राफिक चरणों के माध्यम से शुद्ध होता है। हम संरचना निर्धारण के लिए क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं और डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण रणनीतियों का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल NEMO और छोटे अणु अवरोधकों के परिसरों की संरचना निर्धारण के लिए व्यापक प्रयोज्यता मिल जाएगा ।
Introduction
भड़काऊ और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, सेल डेथ या अस्तित्व और प्रसार1के लिए जिम्मेदार लक्षित जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए साइटोकिन्स, माइक्रोबियल उत्पादों और तनाव सहित विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में एनएफ-बी बी मार्ग सक्रिय होता है। भड़काऊ और ऑटोइम्यून रोगों और कैंसर2,3,4,5 सहित विकृतियों को मार्ग के हाइपरएक्टिवेशन से सहसंबद्ध किया गया है, जिसने एनएफ-बी गतिविधि के मॉड्यूलेशन को नए उपचारों के विकास के लिए एक प्रमुख लक्ष्य बना दिया है6,7।
विशेष रूप से विहित एनएफ-बी मार्ग को गैर-विहित मार्ग से प्रतिष्ठित किया गया है, जो लिम्प्रोगेनोजेनेसिस और बी-सेल सक्रियण के लिए जिम्मेदार है, मचान प्रोटीन नीमो (एनएफ-बी आवश्यक मॉड्यूलेटर8)पर पूर्व की निर्भरता के द्वारा किनास IKKα और IKKο के साथ आईसीएके-कॉम्प्लेक्स की असेंबली के लिए। आईकेके कॉम्प्लेक्स IinBα (IB के अवरोधक) के फॉस्फोरिलाइजेशन के लिए जिम्मेदार है जो इसे गिरावट के लिए लक्षित करता है, एनएफ-बी डिमर्स को जीन ट्रांसक्रिप्शन1 के लिए नाभिक में स्थानांतरित करने के लिए मुक्त करता है और इसलिए एनएफ-बी गतिविधि को संग्राहक करने के लिए अवरोधकों के विकास के लिए एक आकर्षक लक्ष्य है।
हमारा शोध निमो और IKKο के बीच प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत के लक्षण वर्णन पर केंद्रित है, जो IKK परिसर गठन के छोटे अणुओं अवरोधकों के विकास के लिए निमो को लक्षित करता है। IKKο को बांधने के लिए आवश्यक निमो का न्यूनतम बाध्यकारी डोमेन, अवशेषों को 44-111 शामिल करता है, और इसकी संरचना को IKKο अनुक्रम 701-7459के अनुरूप पेप्टाइड के साथ जटिल रूप से निर्धारित किया गया है। NEMO और IKKο एक चार हेलिक्स बंडल बनाते हैं जहां NEMO डिमर एक विस्तारित इंटरैक्शन इंटरफेस के साथ एक विस्तारित खुली नाली में IKKο (701-745) के दो हेलीज को समायोजित करता है। IKKο (734-742), जिसे नीमो-बाध्यकारी डोमेन (एनबीटी) के रूप में भी जाना जाता है, बाध्यकारी के लिए सबसे महत्वपूर्ण हॉट-स्पॉट को परिभाषित करता है, जहां दो आवश्यक ट्रिप्टोफंस (739,741) निमो जेब के भीतर गहराई से दफनाते हैं। जटिल संरचना का विवरण एनएमओ को लक्षित करने वाले छोटे अणु अवरोधकों के संरचना-आधारित डिजाइन और अनुकूलन में सहायता कर सकता है। इसके साथ ही, यह मुश्किल है कि एक छोटे अणु या पेप्टाइड के बंधन NEMO में पूर्ण संरचना परिवर्तन विश्राम होगा (यानी, NEMO कुंडलित कुंडल-कुंडल डिमर के व्यापक उद्घाटन) लंबे IKKο (701-745) के बंधन के कारण, के रूप में क्रिस्टल में मनाया, और अबाध्य NEMO या NEMO की संरचना एक छोटे अणु अवरोधक के लिए बाध्य
आईकेआर-बाध्यकारी डोमेन को शामिल करने वाले पूर्ण लंबाई नीमो और छोटे ट्रंकेशन निर्माण एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) विधियों10के माध्यम से अनबाउंड रूप में संरचना निर्धारण के लिए असभ्य साबित हुए हैं, जिसने हमें एनओएमओ के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का एक बेहतर संस्करण डिजाइन करने के लिए प्रेरित किया। दरअसल, अनबाउंड रूप में निमो (44-111) केवल आंशिक रूप से मुड़ा हुआ है और प्रवर्तक आदान-प्रदान से गुजरता है और इसलिए हम IKKο के लिए बाध्यकारी आत्मीयता को संरक्षित करते हुए अपनी मंद संरचना, कुंडलित-कुंडली गुना और स्थिरता को स्थिर करने के लिए तैयार हैं। प्रोटीन के एन-और सी-टर्मिनी में आदर्श डिमेरिक कॉइल-कॉइलदृश्यों 11 के तीन हेप्टाड को जोड़कर, और चार सूत्री म्यूटेशन की एक श्रृंखला, हमने निमो-ईईएए उत्पन्न की, जो पूरी तरह से मंद और एक कुंडलित कुंडली में मुड़ा हुआ है, जिसने पूरी लंबाई NEMO12के लिए मनाया गया नैनोमोलर रेंज के लिए IKK-बाध्यकारी आत्मीयता को बचाया। एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, हमें आशा है कि कुंडलित-कुंडली एडाप्टर (जीसीएन4 अनुक्रम के आधार पर) क्रिस्टलीकरण की सुविधा होगी और अंततः आणविक प्रतिस्थापन के माध्यम से एक्स-रे संरचना निर्धारण में सहायता करेगा। कुंडलित-कुंडलित एडाप्टर का उपयोग इसी प्रकार स्थिरता बढ़ाने, समाधान व्यवहार में सुधार करने और ट्रिमेरिक कुंडलित कुंडल और एंटीबॉडी टुकड़ों13,14के लिए क्रिस्टलीकरण की सुविधा के लिए किया गया है। NEMO-EEAA आसानी से व्यक्त किया जाता है और एस्चेरिचिया से शुद्ध किया जाता है। कोलाई कोशिकाएं एक क्लेवबल हिस्टिडीन टैग के साथ, घुलनशील है, एक स्थिर मंद कुंडलित कुंडलित कुंडली में मुड़ा हुआ है और आसानी से क्रिस्टलीकृत है, जिसमें 1.9 Å तक विवर्तन होता है। जीसीएन4 के आदेश ित कुंडलित-कुंडलक्षेत्रों की उपस्थिति जीसीएन415की ज्ञात संरचना का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन द्वारा एनएमओ-ईईएए के क्रिस्टल से डेटा को चरणबद्ध रूप से चरणबद्ध रूप से चरणबद्ध रूप से प्राप्त करने में सहायता कर सकती है।
एपीओ-NEMO-EEAA के साथ प्राप्त परिणामों को देखते हुए, हमारा मानना है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी छोटे पेप्टाइड्स (NBD पेप्टाइड की तरह) या छोटे अणु अवरोधकों की उपस्थिति में NEMO-EEAA के क्रिस्टलीकरण के लिए लागू किया जा सकता है, NEMO अवरोध और संरचना के लिए आवश्यकताओं को समझने के लक्ष्य के साथ उच्च समृद्धि के लिए प्रारंभिक सीसा अवरोधकों के अनुकूलन आधारित । कई कुंडलित-कुंडलित डोमेन16की प्लास्टिसिटी और गतिशील प्रकृति को देखते हुए, कुंडलित-कुंडली अनुकूलकों के उपयोग से संरचनात्मक निर्धारण को सहायता करने में अधिक सामान्य प्रयोज्यता मिल सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अनबाउंड रूप में एनओएमओ के क्रिस्टलीकरण के प्रयास असफल रहे, जिनमें पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन का उपयोग करने के प्रयास और आईकेके-बाध्यकारी डोमेन को शामिल करते हुए कई ट्रंकेशन निर्माण शामिल हैं। परिपत्र ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस परियोजना के दौरान कई उपयोगी चर्चाओं के लिए प्रो डी झुंझलाना को धन्यवाद देते हैं । हम प्रो डी बोलन को अनुकूलित GCN4 कुंडलित कुंडलित कुंडलवाले प्लाज्मिड के उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं। हम निमो प्लाज्मिड्स के लिए डॉ बी गुओ को धन्यवाद देते हैं । हम प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए क्रिस्टीना आर अर्नोल्डी, तमाड़ बासीश्विली और एमी ई कैनेडी का शुक्रिया अदा करते हैं । हम उनके समर्थन के लिए क्रिस्टलोग्राफी उपकरण और बायोएमटी कर्मियों के उपयोग के लिए डार्टमाउथ में बायोएमटी क्रिस्टलोग्राफी कोर सुविधा और रसायन विज्ञान और बायोकेमिस्ट्री और सेल बायोलॉजी के विभागों को धन्यवाद देते हैं। इस शोध में नेशनल सिंक्रोट्रॉन लाइट सोर्स II के एएमएक्स बीमलाइन का इस्तेमाल किया गया, जो अमेरिका के ऊर्जा विभाग (डीओई) ऑफिस ऑफ साइंस यूजर फैसिलिटी का इस्तेमाल किया गया है, जो कॉन्ट्रैक्ट नंबर एक के तहत ब्रुकहेवन नेशनल लेबोरेटरी द्वारा डीओई ऑफिस ऑफ साइंस के लिए संचालित है । डी-एससी0012704। हम एनएसएलएस द्वितीय में कर्मचारियों को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को NIH अनुदान R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 और P20GM113132, और एक मुंक-Pfefferkorn उपन्यास और इंटरएक्टिव अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
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