Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO
Summary
Wir beschreiben Protokolle zur Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO durch Röntgenkristallographie. Die Methoden umfassen Proteinexpression, Reinigung und Charakterisierung sowie Strategien zur erfolgreichen Kristalloptimierung und Strukturbestimmung des Proteins in seiner ungebundenen Form.
Abstract
NEMO ist ein Gerüstprotein, das eine wesentliche Rolle im NF-B-Signalweg spielt, indem es den IKK-Komplex mit den Kiinasen IKK und IKK zusammenbaut. Bei aktivierung phosphoryliert der IKK-Komplex die I-B-Moleküle, die zur NF-B-Kerntranslokation und Aktivierung von Zielgenen führen. Die Hemmung der NEMO/IKK-Wechselwirkung ist ein attraktives therapeutisches Paradigma für die Modulation der NF-B-Signalwegaktivität, was NEMO zu einem Ziel für das Design und die Entdeckung von Inhibitoren macht. Um den Prozess der Entdeckung und Optimierung von NEMO-Inhibitoren zu erleichtern, haben wir ein verbessertes Konstrukt der IKK-bindungsdomäne von NEMO entwickelt, das eine Strukturbestimmung des Proteins in der Apo-Form und gleichzeitig an kleine Molekulargewichtsinhibitoren gebunden. Hier stellen wir die Strategie für die Gestaltung, den Ausdruck und die strukturelle Charakterisierung der IKK-Bindungsdomäne von NEMO vor. Das Protein wird in E. coli-Zellen exprimiert, unter denatierenden Bedingungen solubilisiert und durch drei chromatographische Schritte gereinigt. Wir diskutieren die Protokolle zur Gewinnung von Kristallen zur Strukturbestimmung und beschreiben Datenerfassungs- und Analysestrategien. Die Protokolle werden eine breite Anwendbarkeit auf die Strukturbestimmung von Komplexen von NEMO und kleinen Molekülinhibitoren finden.
Introduction
Der NF-B-Signalweg wird als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen aktiviert, einschließlich Zytokine, mikrobielle Produkte und Stress, um die Expression von Zielgenen zu regulieren, die für entzündliche und Immunantwort, Zelltod oder Überleben und Proliferation verantwortlich sind1. Pathologien wie entzündliche und Autoimmunerkrankungen und Krebs2,3,4,5 wurden mit der Hyperaktivierung des Signalwegs korreliert, die Modulation der NF-B-Aktivität zu einem Hauptziel für die Entwicklung neuer Therapien6,7gemacht hat.
Insbesondere der kanonische NF-B-Signalweg unterscheidet sich von dem nicht-kanonischen Weg, der für die Lymphorganogenese und Die B-Zell-Aktivierung verantwortlich ist, durch die Abhängigkeit des erstgenannten vom Gerüstprotein NEMO (NF-B essential modulator8) für die Montage des IKK-Komplexes mit den Kiinasen IKK. Der IKK-Komplex ist verantwortlich für die Phosphorylierung von I-B (Inhibitor von B), die auf den Abbau abzielt, wodurch die NF-B-Dimere in den Kern für die Gentranskription1 transloziert werden können und ist daher ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Inhibitoren zur Modulation der NF-B-Aktivität.
Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen NEMO und IKK, die auf NEMO für die Entwicklung kleiner Moleküle Inhibitoren der IKK-Komplexbildung abzielt. Die minimale Bindungsdomäne von NEMO, die zur Bindung von IKK benötigt wird, umfasst die Rückstände 44-111, und ihre Struktur wurde komplex mit einem Peptid bestimmt, das der IKK-Sequenz 701-7459entspricht. NEMO und IKK bilden ein Vier-Helix-Bundle, in dem der NEMO-Dimer die beiden Helices von IKK(701-745) in einer länglichen offenen Nut mit einer erweiterten Interaktionsschnittstelle unterbringt. Der ikK(734-742), auch bekannt als NEMO-Bindungsdomäne (NBD), definiert den wichtigsten Hot-Spot für die Bindung, an dem die beiden wesentlichen Tryptophans (739,741) tief in der NEMO-Tasche vergraben sind. Die Details der komplexen Struktur können bei der strukturbasierten Gestaltung und Optimierung von kleinen Molekülinhibitoren helfen, die auf NEMO abzielen. Gleichzeitig ist es schwierig, dass die Bindung eines kleinen Moleküls oder Peptids in NEMO die vollständige Konformationsänderung (d. h. die umfangreiche Öffnung des NEMO-Spulendimers) durch Bindung des langen IKK(701-745), wie im Kristall beobachtet, wieder aufbaut und die Struktur eines ungebundenen NEMO oder NEMO, der an einen kleinen Molekülinhibitor gebunden ist, ein besseres Ziel für die strukturbasierte Entwicklung und Optimierung darstellen kann.
NEMO- und kleinere Schnittkonstrukte in voller Länge, die die IKK-Bindungsdomäne umfassen, haben sich über Röntgenkristallographie und Kernspinresonanz (NMR)-Methoden10als unlösbar für die Strukturbestimmung in der ungebundenen Form erwiesen, was uns dazu veranlasste, eine verbesserte Version der IKK-Bindungsdomäne von NEMO zu entwerfen. Tatsächlich ist NEMO (44-111) in ungebundener Form nur teilweise gefaltet und durchläuft einen Konformationsaustausch, und deshalb haben wir uns vorgenommen, seine dimerische Struktur, die gewickelte Spulenfalte und die Stabilität zu stabilisieren und gleichzeitig die Bindungsaffinität für IKK zu erhalten. Durch das Anhängen von drei Heptads mit idealen dimeren Coil-Spulensequenzen11 an der N- und C-Termini des Proteins und einer Reihe von Vierpunktmutationen erzeugten wir NEMO-EEAA, ein Konstrukt, das vollständig dimer und in einer gewickelten Spule gefaltet wurde und die IKK-Bindungsaffinität zum Nanomolar-Bereich rettete, wie bei NEMO12in voller Länge beobachtet. Als zusätzlichen Vorteil hofften wir, dass die Coiled-Coil-Adapter (basierend auf der GCN4-Sequenz) die Kristallisation erleichtern und schließlich bei der Bestimmung der Röntgenstruktur durch molekularen Ersatz helfen würden. Coiled-Coil-Adapter wurden in ähnlicher Weise verwendet, um sowohl die Stabilität zu erhöhen, das Lösungsverhalten zu verbessern und die Kristallisation für trimergewickelte Coils und Antikörperfragmente zu erleichtern13,14. NEMO-EEAA ist leicht exprimiert und gereinigt von Escherichia. coli-Zellen mit einem setakeablen Histidin-Tag, ist löslich, in einer stabilen dimeren gewickelten Spule gefaltet und leicht kristallisiert, mit Beugung bis 1,9 °C. Das Vorhandensein der geordneten Coiled-Coil-Regionen von GCN4 könnte zusätzlich dazu führen, dass die Daten aus Kristallen von NEMO-EEAA durch molekularen Ersatz unter Verwendung der bekannten Struktur von GCN415schrittweise abgespult werden.
Angesichts der Ergebnisse, die mit apo-NEMO-EEAA erzielt wurden, glauben wir, dass die hier beschriebenen Protokolle auch auf die Kristallisation von NEMO-EEAA in Gegenwart von kleinen Peptiden (wie dem NBD-Peptid) oder kleinen Molekülinhibitoren angewendet werden könnten, mit dem Ziel, die Anforderungen an die NEMO-Hemmung und die strukturbasierte Optimierung von anfänglichen Bleiinhibitoren auf eine hohe Affinität zu verstehen. Angesichts der Plastizität und Dynamik vieler Coiled Coil-Domänen16könnte der Einsatz der Coiled-Coil-Adapter eine allgemeinere Anwendbarkeit bei der Unterstützung der Strukturbestimmung finden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kristallisationsversuche von NEMO in ungebundener Form waren erfolglos, einschließlich Versuchen, das proteinvolle Protein in voller Länge und mehrere Abschneidekonstrukte zu verwenden, die die IKK-Bindungsdomäne umfassen. Unsere biophysikalische Charakterisierung der IKK-bindungsdomäne von NEMO (Rückstände 44-111) durch kreisförmigen Dichroismus, NMR-Spektroskopie und Fluoreszenz-Anisotropie zeigte, dass das Konstrukt, wenn auch in der Lage, IKK zu binden, in einem Zustand des Konformationsaustauschs existierte, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Prof. D. Madden für viele hilfreiche Diskussionen während dieses Projekts. Wir danken Prof. D. Bolon für die Gabe des Plasmids, das die optimierte GCN4-Spule enthält. Wir danken Dr. B. Guo für NEMO-Plasmide. Wir danken Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili und Amy E. Kennedy für die Demonstration des Verfahrens. Wir danken der BioMT Crystallography Core Facility und den Abteilungen für Chemie und Biochemie & Zellbiologie in Dartmouth für den Einsatz der Kristallographiegeräte und des BioMT-Personals für ihre Unterstützung. Diese Forschung verwendete die AMX-Beamline des National Synchrotron Light Source II, einer VomO-Abteilung für Energie (DOE) des US-Amerikanischen Energieministeriums (DOE), die für das DOE Office of Science vom Brookhaven National Laboratory unter Vertrag Nr. DE-SC0012704. Wir danken den Mitarbeitern von NSLS II für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 und P20GM113132 sowie ein Munck-Pfefferkorn Roman- und Interaktives Stipendium finanziert.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
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