NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정
Summary
우리는 X 선 결정학에 의하여 NEMO의 IKK 결합 도메인의 구조 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 단백질 발현, 정제 및 특성화뿐만 아니라 단백질의 성공적인 결정 최적화 및 단백질의 구조 측정을 위한 전략을 포함합니다.
Abstract
NEMO는 키나아제 IKKα 및 IKKβ와 함께 IKK 복합체를 조립함으로써 NF-θB 통로에서 필수적인 역할을 하는 스캐폴딩 단백질이다. 활성화시, IKK 복합체는 NF-θB 핵 전좌 및 표적 유전자의 활성화로 이어지는 IθB 분자를 인산화한다. NEMO/IKK 상호 작용의 억제는 NF-θB 통로 활동의 변조를 위한 매력적인 치료 패러다임, 억제제 설계 및 발견을 위한 NEMO를 표적으로 만들기. NEMO 억제제의 발견 및 최적화 과정을 용이하게 하기 위해, 우리는 작은 분자량 억제제에 결합하는 동안 아포 형태로 단백질의 구조 측정을 허용하는 NEMO의 IKK 결합 도메인의 개선된 구성을 설계했습니다. 여기서는 NEMO의 IKK 바인딩 도메인의 설계, 표현 및 구조적 특성화에 활용되는 전략을 제시합니다. 단백질은 대장균 세포에서 발현되고, 변성 조건 하에서 용해되고 3개의 크로마토그래피 단계를 통해 정제된다. 구조 측정을 위한 결정 얻기 위한 프로토콜에 대해 논의하고 데이터 수집 및 분석 전략을 설명합니다. 프로토콜은 NEMO 및 소분자 억제제의 복합체의 구조 결정에 넓은 적용성을 찾을 수 있습니다.
Introduction
NF-θB 통로는 사이토카인, 미생물 생성물 및 스트레스를 포함하는 다양한 자극에 반응하여 활성화되어, 염증 및 면역 반응, 세포 사멸 또는 생존 및 증식을 담당하는 표적 유전자의 발현을 조절한다1. 염증성 및 자가면역질환 및암을포함하는 병리학2,3,4,5는 NF-θB 활성의 변조를 새로운 치료법의 개발을 위한 주요 표적으로 삼고 있는 경로의 과활성화와 상관되어 있다6,7.
정식 NF-θB 통로는 특히 비정형 경로로부터 구별되며, 림프형성 및 B 세포 활성화를 담당하며, 비계 단백질 NEMO(NF-θB 필수 변조기8)에대한 전의 의존성으로 인해 IKK 복합체의 키나세 IKK및 IKKk와 의 조립된다. IKK 복합체는 분해를 대상으로 하는 IθBα(θB의 억제제)의 인산화를 담당하며, NF-θB 이dim제가 유전자 전사1을 위해 핵으로 전이되도록 해방시키고, 따라서 NF-θB 활성을 조절하는 억제제의 개발을 위한 매력적인 표적이된다.
우리의 연구는 NEMO와 IKKβ 사이의 단백질-단백질 상호 작용의 특성화에 초점을 맞추고, IKK 복합체 형성의 소분자 억제제개발을 위해 NEMO를 표적으로 합니다. IKKβ를 결합하는 데 필요한 NEMO의 최소 결합 도메인은 잔기 44-111을 포함하며, 그 구조는 IKKβ 서열 701-7459에대응하는 펩티드와 함께 복합적으로 결정되었다. NEMO 및 IKKβ는 NEMO 디머가 연장된 상호 작용 인터페이스를 가진 길쭉한 열린 홈에서 IKKβ(701-745)의 두 가지 나선을 수용하는 4-나선 번들을 형성합니다. IKKβ (734-742), 또한 NEMO 바인딩 도메인으로 알려진 (NBD), 바인딩에 대 한 가장 중요 한 핫스팟을 정의, 어디 두 개의 필수 트립토판스 (739,741) NEMO 주머니 내에서 깊이 묻혀. 복잡한 구조의 세부 사항은 NEMO를 표적으로 하는 작은 분자 억제제의 구조 기지를 둔 디자인 그리고 최적화에서 원조할 수 있습니다. 동시에, 결정에서 관찰된 바와 같이, 결정에서 관찰된 바와 같이, 소분자 또는 펩티드의 결합이 NEMO에서 완전한 형태 변화(즉, NEMO 코일 코일-코일 디머의 광범위한 개구부)를 재구성하는 것은 어렵다, 및 작은 분자 억제제에 결합된 UNBOUND NEMO 또는 NEMO의 구조는 더 나은 표적 을 위한 표적 을 나타낼 수 있다.
IKK 결합 도메인을 포괄하는 전체 길이 NEMO 및 더 작은 잘림 구조는 X선 결정학 및 핵 자기 공명(NMR) 방법10을통해 언바운드 형태로 구조 측정을 위해 난치성으로 입증되었으며, 이는 NEMO의 IKK 결합 도메인의 개선된 버전을 설계하도록 유도했습니다. 실제로, 언바운드 형태의 NEMO (44-111)는 부분적으로 접혀 있고 형태 교환을 거치므로 IKKβ에 대한 결합 친화도를 유지하면서 그 다이머지 구조, 코일 코일 접기 및 안정성을 안정화하도록 설정합니다. 단백질의 N-및 C-termini에서 이상적인 디메릭 코일 코일 코일 서열11의 3개의 heptads를, 그리고 4점 돌연변이의 시리즈를 결합하여, 우리는 NEMO-EEAA, 완전 증분 및 코일 코일에 접힌 구성을 생성하여, 전체 길이 NEMO1에대해 관찰된 바와 같이 나노몰 범위에 IKK 결합 친화도를 구출하였다. 추가적인 이점으로, 우리는 코일 코일 어댑터(GCN4 서열에 기반)가 결정화를 용이하게 하고 결국 분자 교체를 통한 X선 구조 결정에 도움이 되기를 희망했습니다. 코일 코일 어댑터는 유사하게 안정성을 높이고, 용액 거동을 개선하며, 트리머 코일 코일 및 항체단편(13,14)에대한 결정화를 용이하게 하기 위해 유사하게 이용되고 있다. NEMO-EEAA는 대장균 세포에서 쉽게 발현되고 정제되며, 용해성이며, 안정된 디메릭 코일 코일 코일에 접혀 1.9 Å로 회절하여 쉽게 결정화됩니다. GCN4의 주문된 코일 코일 영역의 존재는 GCN415의공지된 구조를 사용하여 분자 대체에 의해 NEMO-EEAA의 결정으로부터 데이터를 스테이징하는 데 추가로 도움이 될 수 있다.
apo-NEMO-EEAA로 얻은 결과를 감안할 때, 우리는 여기에 기술된 프로토콜이 NEMO 억제제(NBD 펩티드 와 같은) 또는 소분자 억제제의 존재 시 NEMO-EEAA의 결정화에도 적용될 수 있다고 믿으며, 이는 초기 억제제의 NEMO 억제 및 구조 기반 최적화에 대한 요구 사항을 이해하는 것을 목표로 합니다. 많은 코일 코일 도메인(16)의가소성과 동적 특성을 감안할 때, 코일 코일 어댑터의 사용은 구조적 결정에 도움이 더 일반적인 적용성을 찾을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
UNBOUND 형태로 NEMO의 결정화 시도는 IKK 결합 도메인을 포괄하는 전신 단백질 및 여러 잘림 구수를 사용하는 시도를 포함하여 실패했다. 우리의 생체물리학적 특성은 NEMO의 IKK 결합 도메인(잔류물 44-111)에 의한 원형 이색증, NMR 분광법 및 형광 이방성으로, IKKβ를 결합할 수 있지만,결정화에 적합하지 않은 형태교환 상태로 존재한다는 것을나타냈다. 우리?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트 전반에 걸쳐 많은 유용한 토론을 해주신 D. 매든 교수님께 감사드립니다. 우리는 최적화 된 GCN4 코일 코일을 포함하는 플라스미드의 선물에 대한 교수 D. Bolon 감사합니다. NEMO 플라스미드에 대해 B. Guo 박사님께 감사드립니다. 크리스티나 R. 아놀디, 타마 바시아시빌리, 에이미 E. 케네디에게 절차를 시연해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 BioMT 결정학 핵심 시설 및 다트머스의 화학 및 생화학 및 세포 생물학 부서의 결정학 장비 및 BioMT 인력의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 국립 싱크로트론 광원 II의 AMX 빔 라인을 사용, 에너지의 미국 학과 (DOE) 계약 번호에 따라 브룩 헤븐 국립 연구소에 의해 과학의 DOE 사무실을 위해 운영 과학 사용자 시설의 사무실. DE-SC0012704. NSLS II의 직원들의 지원에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R03AR066130, R01GM133844, R35GM12863 및 P20GM113132, 그리고 멍크-Pfefferkorn 소설 및 대화 형 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
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