Målet med detta protokoll var att utveckla en murin modell av låg nivå toxiskt exponering som inte orsakar öppen leverskada, utan snarare förvärar redan existerande leverskada. Detta paradigm rekapitulerar bättre mänsklig exponering och de subtila förändringar som sker vid exponering för toxiskt koncentrationer som anses säkra.
Vinylklorid (VC), en riklig miljöförorening, orsakar steatohepatit på höga nivåer, men anses säker på lägre nivåer. Även om flera studier har undersökt rollen av VC som en direkt hepatotoxicant, konceptet att VC ändrar känsligheten i levern till andra faktorer, såsom alkoholfria fettlever (NAFLD) orsakad av fettrik diet (HFD) är ny. Detta protokoll beskriver ett exponerings paradigm för att utvärdera effekterna av kronisk, låg nivå exponering för VC. Möss är acklierade till fettsnål eller fettsnål diet en vecka före början av inhalations exponeringen och kvar på dessa dieter hela experimentet. Möss exponeras för VC (del OSHA-nivå: < 1 ppm) eller rumsluft i inhalations kammare under 6 timmar/dag, 5 dagar/vecka, i upp till 12 veckor. Djuren övervakas varje vecka för viktökning och livsmedelskonsumtion. Denna modell av VC-exponering orsakar ingen öppen leverskada med VC inandning ensamt. Emellertid, kombinationen av VC och HFD förbättrar signifikant leversjukdom. En teknisk fördel med denna Co-Exposure modell är hela kroppen exponering, utan återhållsamhet. Dessutom, villkoren närmare liknar en mycket vanlig mänsklig situation av en kombinerad exponering för VC med underliggande alkoholfria fettlever och därför stödja den nya hypotesen att VC är en miljö riskfaktor för utveckling av leverskada som en komplikation av fetma (dvs. NAFLD). Detta arbete utmanar paradigmet att de nuvarande exponeringsgränserna för VC (arbets-och miljö) är säkra. Användningen av denna modell kan sprida nytt ljus och oro för riskerna med VC-exponering. Denna modell av toxicant-inducerad leverskada kan användas för andra flyktiga organiska föreningar och att studera andra interaktioner som kan påverka levern och andra organsystem.
Många gifter är närvarande i luften vi andas på mycket låga nivåer. Vinylklorid (VC) är monomerisk gas som används av industrin för att skapa polyvinylklorid (PVC) plastprodukter1. Det är en utbredd miljö hepatotoxicant, känd carcinogen, och rankas #4 på ATSDR prioriterade ämne lista2. För att bättre förstå de toxiska effekterna på människors hälsa och interaktioner med befintliga komsjukligheter är det avgörande att fastställa exponeringsmodeller som efterliknar exponeringen hos människor. Det primära intresset för denna grupp är att studera levereffekterna av kronisk VC-exponering vid låga koncentrationer. VC utövar sina huvudsakliga effekter på levern, där det har visats (vid höga koncentrationer) att orsaka steatos, och toxicant-associerade steatohepatit (Tash) med nekros, fibros, cirros3,4, samt Hepatocellulär cancer (HCC) och den annars extremt sällsynta hepatiska hemangiosarcoma5. Tash har sannolikt funnits i befolkningen i årtionden men förblev okarakteriserad och underskattat av utredarna4,6. Som ett resultat av forskning som visar de direkta toxicitetsproblemen för VC-exponering sänkte arbetsmiljö förvaltningen (OSHA) den godtagbara exponerings tröskeln till 1 ppm under en 8 h arbetsdag7. Även om exponerings tröskeln har sänkts, är effekten av denna koncentration av VC på människors hälsa oklar7. Dessutom, effekten av VC exponering på befintliga comorbidities, såsom leversjukdom, är till stor del okänd8. Detta kunskapsgap är särskilt viktigt i dag på grund av den ökande globala prevalensen av alkoholfria fettlever (nalfd)4,6,7,9,10,11,12. Viktigt, VC har nyligen visat sig vara en oberoende riskfaktor för leversjukdom från andra orsaker13. Målet med detta protokoll var därför att utveckla en relevant inhalations modell för exponering för den flyktiga miljötoxikan, VC i samband med underliggande leverskada, för att efterlikna mänsklig exponering och identifiera potentiella, nya mekanismer för VC-inducerad eller VC-förstärkt leverskada.
Den huvudsakliga exponeringsvägen för många miljögifter och föroreningar sker via inandning. När inhalerat, föreningen kan ange systemisk cirkulation genom lungorna, resa till levern, och bli metaboliskt aktiveras av leverenzymer innan de utsöndras14,15,16. Det är ofta dessa aktiva metaboliter som orsakar toxicitet och skador i kroppen. Tidigare studier av denna grupp och andra har använt VC metaboliter som ersättningar för exponering för VC gas17,18. Andra grupper har använt inhalations modeller av VC; emellertid, extremt höga exponeringsnivåer (> 50 ppm) genomfördes för att inducera akut toxicitet, allvarlig leverskada, och tumörutveckling19. Även om dessa studier har gett viktig information och mekanismer för VC-inducerad cancerogenitet, de inte recapitulate de subtila effekter och komplexa interaktioner med andra bidragande faktorer och därför är mindre relevanta för människors exponering.
Den VC-inandning plus fettrik diet (HFD) modell som beskrivs här (se figur 1 för tidslinje), är den första modellen av kronisk, lågdos VC exponering (dvs., sub-OSHA koncentration), där möss utsätts för toxiskt under förhållanden som imiterar människors exponering mycket närmare. I själva verket, data från denna modell återfått resultat observerats hos människor som exponeras för VC, såsom inverkan på metaboliska vägar20, oxidativ stress och mitokondriell dysfunktion4. Andra musmodeller av inandning, såsom huvud-bara och näsa-endast modeller21, kräver att djuret vara återhållsamma, orsakar stress för djuret. Här, denna hela kroppen exponeringsmetod kräver inte injektion eller onödiga stress till djuren. Djuren har AD libitum tillgång till mat och vatten och placeras inom den större inhalations kammaren för ett bestämt antal timmar per dag och dagar per vecka. Dessutom, konceptet att VC ändrar känslighet för en annan hepatotoxicant är ett nytt fynd, först visat av denna grupp12 och har konsekvenser för VC exponering vid koncentrationer långt under de som behövs för direkt levertoxicitet.
Denna metod för inhalationsexponering kan användas för att efterlikna exponering för en mängd olika gasformiga gifter, inklusive andra flyktiga organiska föreningar, som finns i vår miljö. Faktum är att flyktiga organiska föreningar är en stor grupp av miljögifter och vanligare i industrialiserade områden, vilket resulterar i att vissa populationer har högre risk för kronisk exponering22. Detta protokoll kan modifieras för att passa olika experimentella frågor. Längden på tid och koncentration av sammansatta administreras kan varieras. Även initialt utvecklats för bestämning av leverskada, andra organsystem kan och har studerats med denna modell23. Utredare som syftar till att studera kroniska exponeringar med djur, men vill minimera djurens stress, bör överväga att använda denna modell.
Denna modell av VC-förstärkt NAFLD är en ny metod för att utvärdera effekten av sub-OSHA gräns VC exponering i ett hela kroppen inandning paradigm. Denna modell tillåter utredare att studera sub-hepatotoxiska och sensibiliserande effekter av låga nivåer av VC ensam. Faktum är att denna Co-exponering modell uppnår förbättrad leverskada, förhöjning av plasma ALAT och ASAT och måttlig inflammation, men i stort sett inte påverkar andra organsystem, såsom hjärta, vid denna koncentration23. Denna kroniska modell kräver helkropps inhalations kammare men minimerar stress och exponeringskoncentrationer. Även om det protokoll som presenteras här är en mjukvarustyrd strategi, har vår erfarenhet visat att den manuella metoden också är en korrekt och konsekvent metod för exponering12,24. Dessutom är det lätt att tillämpas på flera forskningsområden inklusive andra organskador23 orsakas av flyktiga organiska sammansatta exponering22. I synnerhet kan denna modell närmare likna patogenesen av Human Co-exponeringar mot miljö kemikalier och bakomliggande sjukdom5.
För att uppnå liknande resultat måste vissa kritiska steg i protokoll optimeringen uppnås. Utredarna måste till exempel fastställa att koncentrationen av VC eller annan toxicitet inom kamrarna ligger inom det önskade exponeringsintervallet (dvs. låg nivå, subosha eller akuta nivåer). Optimera detta steg i inhalations kammaren är avgörande för en framgångsrik modell av mänsklig exponering av intresse. För det andra kan justering av exponeringstiden per dag och experimentets varaktighet också ändras. Enligt denna grupps intresse uppnåddes en arbetsmiljö exponering, och ytterligare en parameter av diet studerades också. Miljö-och akut exponeringar kan dock också modelleras med detta protokoll.
Detta arbete utmanar paradigmet att nuvarande exponeringsgränser för VC (arbets-och miljö) är säkra. Även om den nuvarande OSHA exponeringsgränsen för VC är 1 ppm, denna modell har visat att koncentrationer av VC under denna gräns är tillräckliga för att förbättra leverskada orsakad av HFD hos möss. Detta protokoll gör det möjligt för utredare att studera och karakterisera ett nytt toxiskt exponerings paradigm och modellera TASH.
Detta är den första modellen av kronisk, lågdos VC-exponering. Tidigare arbete används mycket höga boluskoncentrationer, akuta exponeringar eller aktiva metaboliter som ersättningar för VC-exponering. Alla dessa metoder minskar relevansen av resultaten för människors exponering. Därför, denna nya modell av TASH-NAFLD interaktion ger den nödvändiga plattformen för utredare att undersöka komplexa interaktioner av lågnivå VC exponering.
Denna modell av toxicant-inducerad leverskada kan användas för andra flyktiga organiska föreningar och även för att studera andra interaktioner som kan påverka levern och andra organsystem8,22,23. Dessutom har denna modell varit, och kan vara ytterligare, används för att undersöka interventions terapier och djupgående mekanistiska studier av verkningssätt för denna utbredda toxiskt24. Som VC är en känd cancerframkallande26,27,28, denna exponering paradigm kan också ändras för studiet av VC-inducerad cancer. Andra komsjuklighet som alkoholhaltiga leversjukdom kan också förstärkas genom VC Co-exponering. Dessutom, det skulle vara av intresse att studera olika typer av fett, såsom fleromättat fett18,29,30, eller olika typer av kolhydrater31 och deras co-exponering med VC i denna modell. Faktum är att alla dessa faktorer är kända för att ha differentiella effekter på utvecklingen av leverskada och kan spela en roll i VC-inducerad leversjukdom.
Sammanfattningsvis är detta en ny inhalations modell av miljötoxicant-inducerad leverskada och etablerar en exponering paradigm för kronisk, låg nivå VC exponering. Koncentrationen av VC som används i denna modell är sub-hepatotoxiska av sig själv, medan det förbättrar leverskada orsakad av en annan faktor (HFD) hos möss. Denna modell gör det möjligt för utredarna att studera mekanismer och interventioner för kronisk VC-toxicitet och kan vara till hjälp för translationella studier som tittar på exponerade försökspersoner och med den högsta risken för exponering.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie finansierades genom utmärkelser från National Institutes of Health (K01 DK096042 och R03 DK107912) till Juliane Beier. Forskning stöddes också av en institutionell utveckling Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under Grant Number P20GM113226 och det nationella institutet för alkoholmissbruk och alkoholism av National Institutes of Health under tilldelnings nummer P50AA024337. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health.
ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
Eosin | Sigma | E6003 | |
Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |