عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد
Summary
باستخدام خلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه البشرية ، ونحن الإبلاغ عن طريقه جديده خاليه من العلامات الحيوية من توصيف وظيفية للخلايا مثل الجذعية بواسطة كروي القائم علي التسمية الاحتفاظ الفحص. يتم وصف بروتوكول خطوه بخطوه ل BrdU ، CFSE ، أو الأحمر البعيد وضع العلامات خليه 2D ؛ تشكيل كروي ثلاثي الابعاد ؛ التسمية الاحتفاظ الجذعية مثل الخلية تحديد من قبل الكيمياء المناعية; والعزلة من قبل FACS.
Abstract
وعلي الرغم من التقدم المحرز في بحوث الخلايا الجذعية البالغة ، لا يزال تحديد وعزل الخلايا الجذعية من عينات الانسجه يشكل تحديا كبيرا. في حين ان الخلايا الجذعية المقيمة هي هادئه نسبيا مع القيود المتخصصة في انسجه الكبار ، فانها تدخل دوره الخلية في الثقافة الثلاثية الابعاد (3D) خاليه من المرساة والخضوع لانقسام الخلايا المتناظرة وغير المتناظرة ، مما يؤدي إلى كل من الجذعية والسلف الخلايا. وتتكاثر هذه الاخيره بسرعة وتشكل الخلية الرئيسية في مراحل مختلفه من التزام بالنسب ، وتشكل خزان غير متجانسة. باستخدام الخلايا الظهاريه البشرية العادية الاساسيه البروستاتا (هبريك) ، تم تطوير الفحص القائم علي الكروي ، والاحتفاظ بالعلامات التي تسمح بتحديد وعزل وظيفي للخلايا الجذعية كروي البدء في قرار خليه واحده.
هبريك أو خطوط الخلايا هي ثنائيه الابعاد (2D) مثقف مع BrdU لمده 10 أيام للسماح بدمجها في الحمض النووي لجميع الخلايا الفاصلة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية تجديد الذاتي. تبدا الغسيل عند الانتقال إلى الثقافة ثلاثية الابعاد لمده 5 أيام ، وخلالها تجدد الخلايا الجذعية ذاتيا من خلال التقسيم غير المتناظر والبدء في تكوين كروي. بينما الخلايا الجذعية ابنه هادئه نسبيا الاحتفاظ بالحمض النووي الأبوي المسمي BrdU ، والأسلاف ابنه تتكاثر بسرعة ، وفقدان التسمية BrdU. ويمكن استبدال BrdU مع CFSE أو الأحمر البعيد الموالية للاصباغ ، والتي تسمح الحية عزل الخلايا الجذعية من قبل FACS. وأكدت خصائص الخلايا الجذعية من قبل في تشكيل كروي المختبر, في اختبارات تجديد الانسجه الجسم الحيوي, وعن طريق توثيق الانقسامات المتماثلة/غير متناظرة الخلايا. يمكن استجواب الخلايا الجذعية المعزولة التي تحتفظ بالملصقات بدقه من خلال الدراسات الجزيئية والبيولوجية المصب ، بما في ذلك الحمض الريبي المتسلسل ، ورقاقه-seq ، والتقاط الخلايا المفردة ، والنشاط الأيضي ، وتنميط البروتين ، والمناعة المناعية ، وتشكيل الانسجه والاهم من ذلك ، فان نهج عزل الخلايا الجذعية الوظيفية الخالي من العلامات يحدد الخلايا الجذعية من عينات السرطان الطازجة وخطوط الخلايا السرطانية من أجهزه متعددة ، مما يوحي بامكانيه تطبيقها علي نطاق واسع. ويمكن استخدامه لتحديد سرطان الخلايا الحيوية مثل الجذع الجذعية ، والادويه الشاشة التي تستهدف الخلايا السرطانية مثل الجذعية ، واكتشاف الأهداف العلاجية الجديدة في السرطان.
Introduction
غده البروستاتا البشرية تحتوي علي ظهاره التلالؤ مع وظيفة سيكريتوري والخلايا القاعدية الكامنة وراء ذلك مع مكون خليه الغدد الصماء العصبية غير عادية. الخلايا الظهاريه ، في هذه الحالة ، يتم إنشاؤها من السكان نادره من الخلايا الجذعية البروستاتا التي هي هادئه نسبيا في الجسم الحي وتعمل كنظام إصلاح للحفاظ علي التوازن الغديه في جميع انحاء الحياة1. وعلي الرغم من العديد من التطورات ، لا يزال تحديد الخلايا الجذعية لبروستاتا وعزلها وظيفيا يشكل تحديا كبيرا في الميدان. ويشيع استخدام الخلايا الجذعية الحيوية ، بما في ذلك المنهجيات القائمة علي علامات سطح الخلية مع قياس التدفق الخلوي لأبحاث الخلايا الجذعية2،3،4. ومع ذلك ، فان النتائج المتعلقة بالإثراء والعزلة تتفاوت علي نطاق واسع باعتبارها داله لمجموعات العلامات وخصوصية الأجسام المضادة5،6، مما يثير تساؤلات حول هويه الخلايا المعزولة. نهج آخر يستخدم علي نطاق واسع لتخصيب الخلايا الجذعية مثل ثلاثي الابعاد (3d) كروي الثقافة2,3,4. في حين ان الخلايا الجذعية المقيمة هي هادئه نسبيا في فيفو مع القيود المتخصصة ، فانها تخضع لانقسام الخلايا في الثقافة مصفوفة 3d (متماثلة وغير متناظرة) ، وتوليد كل من الجذعية وخلايا سلف التي تتكاثر بسرعة نحو النسب التزام7،8. وتشكل الخزان المشكلة خليطا غير متجانس يحتوي علي كل من الخلايا الجذعية وخلايا السلف في مراحل مختلفه من التزام بالنسب ، بما في ذلك الخلايا المبكرة والمتاخره لمرحله السلف. التالي ، فان المقايسات باستخدام الخزان بأكملها ليست الخلية الجذعية الحصرية ، مما يجعل تحديد خصائص الخلايا الجذعية الفريدة غير حاسمه. ولذلك ، فمن المهم لخلق المقايسات لتحديد وفصل الخلايا الجذعية البروستاتا من الأسلاف ابنتهم. وتحقيقا لهذه الغاية ، فان الهدف من البروتوكول الحالي هو إنشاء نظام فحص يسمح بالتحديد والعزل الفعالين للخلايا الجذعية من انسجه البروستاتا البشرية يعقبه تحليل قوي لمجري الهواء لوظائفها البيولوجية.
علي المدى الطويل 5-برومو-2 ‘-ديوكسيريدين (brdu) التسمية-الاحتفاظ يستخدم علي نطاق واسع لفي الجسم المجري والمختبر تتبع سلاله من الخلايا الجذعية علي أساس وقت المضاعفة لفترات طويلة9,10. ويستند النهج الحالي لتحديد الخلايا الجذعية البروستاتا والعزلة الموصوفة هنا علي خصائصها النسبية هادئه وخاصيه الاحتفاظ بالتسمية داخل السكان الظهاريه مختلطة. وعلاوة علي ذلك ، استنادا إلى فرضيه الحمض النووي الخالدة حبلا ، يمكن فقط الخلايا الجذعية الخضوع لانقسام الخلايا غير المتناظرة. الخلية الجذعية تمثل خليه ابنه التي تحتوي علي الحمض النووي الابويه القديمة في حين ان خليه السلف ، وهي خليه ابنه الملتزمة ، يتلقى الحمض النووي توليفها حديثا. يتم استغلال خاصيه الخلايا الجذعية الفريدة الموصوفة أعلاه لتنفيذ وسم BrdU في الخلايا الجذعية الابويه في الثقافات الاوليه ومن ثم تتبع علامتها بعد الانتقال إلى الثقافة الكروية الخالية من المرساة. في حين ان معظم الخلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه تحتفظ القاعدية والعابرة تضخيم النمط الظاهري في الثقافة 2d, وهناك أيضا عدد نادر من الخلايا الجذعية متعددة القوية تجديد والحفاظ علي التوازن الظهاريه كما يتضح من تشكيل خزان أو العضوية المتمايزة تماما مع وسائل الاعلام ثقافة المقابلة عند نقل إلى 3d أنظمه3,12 في البروتوكول الحالي لدينا ، باستخدام هبريك خزان البروستاتا أو بروستاسفيري القائم علي BrdU ، CFSE ، أو الأحمر البعيد اختبارات الاستبقاء تليها الفرز الخلية المنشطة فلوري (FACS) ، ونحن تحديد الخلايا الجذعية الاحتفاظ بالتسمية في خزان علي مستوي خليه واحده13.
والاهم من ذلك ، أكدنا كذلك خصائص الخلايا الجذعية للخلايا المحتفظة بالملصقات في المرحلة المبكرة من الخزان بالمقارنة مع خلايا السلف التي لديها التزام بالنسب. وتشمل هذه الانقسام الخلايا الجذعية غير المتماثلة, في المختبر القدرة علي تكوين كروي وفي الجسم الحيوي تجديد القدرات, النشاط الغيار التلقائية مرتفعه, التكوين الإحيائي المعزز وانخفاض النشاط الأيضي. وفي وقت لاحق ، اجري تحليل RNAseq. ولوحظت الجينات بشكل مختلف في الخلايا الكروية الاحتفاظ التسمية التي قد تكون بمثابه العلامات الحيوية الجديدة للخلايا الجذعية البروستاتا البشرية. وهذا النهج القائم علي التسمية القائمة علي الكروي يمكن ان ينطبق علي عينات السرطان لتحديد عدد صغير من الخلايا السرطانية مثل الجذعية ، التالي توفير فرص انتقاليه لأداره السكان مقاومه العلاجية13. ويرد أدناه اختبار الاحتفاظ بالتسمية القائم علي بروستاسفيري باستخدام خلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه البشرية (هبريك) كمثال.
Protocol
Representative Results
Discussion
تدفق الخلوي باستخدام عده علامات سطح الخلايا الجذعية هو نهج يستخدم عاده للبحوث الخلايا الجذعية علي الرغم من عدم وجود كل من الخصوصية والانتقائية1,5,6. في حين ان تشكيل كروي في نظام ثقافة 3d هو وسيله أخرى مفيده في إثراء الخلايا الجذعية النادرة م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من المعهد الوطني للسرطان R01-CA172220 (المعمم ، WYH) ، R01-ES02207 (المعمم ، WYH). نشكر النواة تدفق الخلوية في جامعه إلينوي في شيكاغو للحصول علي المساعدة في فرز الخلايا.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
