천연 폴리페놀 커큐민을 사용하여 뇌 조직에서 아밀로이드 플라크의 라벨링 및 이미징
Summary
Curcumin은 아밀로이드 베타 단백질에 우선적으로 결합하고 다른 전통적인 아밀로이드 결합 염료와의 구조적 유사성으로 인해 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 단백질 플라크의 라벨링 및 이미징에 이상적인 플루오로폴링입니다. 아밀로이드 베타 단백질 플라크를 기존의 방법보다 더 효율적이고 저렴하게 라벨을 부착하고 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
아밀로이드 베타 단백질 (Aβ)의 증착은 엑스트라 및 세포 내 공간에서 알츠하이머 병 (AD)의 특징적인 병리학 중 하나입니다. 따라서 AD 뇌 조직에서 Aβ의 존재를 검출하는 것은 AD의 진행을 방지하기 위한 새로운 치료법을 개발하기 위한 유용한 도구이다. 몇몇 고전적인 아밀로이드 결합 염료, 형광질, 화상 진찰 프로브 및 Aβ 특이적 항체는 AD 뇌 조직에서 Aβ 조직화학적으로 검출하기 위하여 이용되었습니다. Aβ 검출을 위해 이러한 화합물을 사용하는 것은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 그러나, 그것의 강렬한 형광 활동 때문에, 높은 친화성, 및 Aβ를 위한 특이성, 전통적인 아밀로이드 결합 염료를 가진 구조적인 유사성, curcumin (Cur) 사후 에 Aβ 패의 표지 그리고 화상 진찰을 위한 유망한 후보입니다 뇌 조직. 허브 쿠르쿠마 롱가에서천연 폴리페놀입니다. 본 연구에서, Cur는 5x 가족 성 알츠하이머 병 (5xFAD)의 유전 마우스 모델과 1 분 이내에 인간 AD 조직모두에서 조직 화학적으로 Aβ 플라크를 라벨로 지정하는 데 사용되었습니다. 큐어의 라벨링 능력은 티오플라빈-S(Thio-S), 콩고 레드(CR), 플루오로옥 C(FJC) 뿐만 아니라 Aβ 특이적 항체(6E10 및 A11)와 같은 기존의 아밀로이드 결합 염료와 비교되었다. 우리는 Cur가 이러한 기존 염료와 비교할 때 Aβ 플라크에 라벨을 부착하고 이미지화하는 가장 저렴하고 가장 빠른 방법이며 Aβ 특이적 항체와 비교할 수 있다는 것을 관찰했습니다. 또한, Cur는 올리고머 및 피브릴과 같은 대부분의 Aβ 종과 결합합니다. 따라서 Cur는 Aβ 플라크에 대한 가장 비용 효율적이고 간단하며 빠른 형광크롬 검출제로 사용될 수 있습니다.
Introduction
알츠하이머병(AD)은 가장 흔한, 연령과 관련된 진행성 신경 질환 중 하나이며 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중하나인 1,2. 학습, 기억, 인식 장애, 신경 정신 장애와 함께,AD에명시 된 일반적인 증상 3 . AD의 병인학이 완전히 해명되지는 않았지만, 사용 가능한 유전적, 생화학적 및 실험적 증거는 Aβ의 점진적증착이 AD4에대한 최종 바이오마커임을 나타낸다. 이 잘못 접힌된 단백질세포 내 및 세포 외 공간에 축적 하 고 시 냅 스 손실에 관여 하는 것으로 생각 됩니다., 증가 neuroinflammation, 그리고 AD에 의해 영향을 받는 뇌의 피 질과 해 마 영역에서 신경 변성5. 따라서 AD 조직에서 Aβ의 조직화학적 검출은 AD 진행을 방지하기 위한 무독성, 항아밀로이드 약물을 개발하는 데 있어 중요한 첫 번째 단계이다.
지난 수십 년 동안, 몇몇 염료 및 항체는 두뇌 조직에 있는 Aβ 패를 표지하고 심상하기 위하여 많은 연구 실험실에 의해 이용되었습니다, 그러나 이 방법의 몇몇은 시간이 소모되고 사용된 염료 또는 항체는 고가, 몇몇 부속을 요구합니다 화학 물질. 따라서 AD 뇌에서 Aβ 플라크를 저렴한 검출 수단으로 개발하면 환영받을 수 있는 새로운 도구가 될 것입니다. 많은실험실은 AD6,7,8,9의치료제뿐만 아니라 라벨링 및 이미징을 위한 유망한 항 아밀로이드 천연 폴리페놀인 Cur를 사용하기 시작했습니다. 그것의 소수성 및 lypophilic 성격, 고전적인 아밀로이드 결합 염료와 구조적 유사성, 강한 형광 활동, Aβ와 결합하는 강한 친화력은 AD 조직 10에 있는 Aβ 플라크의 표지 그리고 화상 진찰을 위한 이상적인 형광포를 만듭니다10 . Aβ 플라크와 올리고머와 의 큐바인드의 존재는 또한 세포 내 공간7,11,12,13에서검출된다. 또한, 5xFAD(5xFAD) 뇌조직에서Aβ 플라크를 5x로 라벨을 붙일 수 있는 최소량(1-10 nM)이 7로 나타났다. 1 nM 농도가 Aβ 플라크의 계수를 위한 최적의 형광 강도를 제공하지는 않지만, 10 nM 이상의 Cur 농도가 그렇습니다. Ran 및 동료14는 디플루오로보론 유도물의 0.2 nM의 낮은 용량이 적외선 프로브뿐만 아니라 생체 내 Aβ 침전물을 거의 검출할 수 있다고 보고했다. 이 복용량은 조직에 Aβ 플라크를 라벨에 충분 여부는 아직 명확 하지 않다. 대부분의 이전 연구는 Cur를 사용하여 Aβ 플라크염색에 20-30분 동안 사용했지만, 최적의 염색은 훨씬 적은 시간이 필요할 수 있습니다.
본 연구는 AD 뇌 조직에 Aβ 플라크를 라벨링하기 위해 Cur가 요구하는 최소 시간을 테스트하고 다른 기존 마우스와 함께 Cur로 염색한 후 5xFAD 마우스에서 뇌 조직의 Aβ 플라크의 라벨링 및 이미징에 대한 민감도를 비교하도록 설계되었습니다. Aβ 결합 염료, 예컨대 티오플라빈-S (티오-S), 콩고 레드 (CR), 및 플루오로 옥 C (FJC). 이러한 고전적인 아밀로이드 결합 염료의 Aβ 라벨링 능력은 5xFAD 마우스및 노화된 인간 AD 및 대조뇌 조직으로부터 파라핀 내장 및 저온 코로나 뇌 섹션에서 의 Cur 염색과 비교되었다. 연구 결과는 Cur 가 Aβ 특이적 항체(6E10)와 유사한 방식으로 Aβ 플라크를 분류하고 티오-S, CR 또는 FJC보다 적당히 더 우수하다고 제안합니다. 또한, 5xFAD 마우스에 대한 경막내 주사를 2-5일 동안 투여했을 때, 혈액-뇌 장벽을 교차시키고 Aβ 플라크7과결합하였다. 흥미롭게도, Cur의 나노몰 농도는 5xFAD 뇌 조직에서 Aβ 플라크를 표지하고 이미지화하는 데 사용되어 왔으며7,14. 더욱이, 코어, 신경염, 확산 및 연소플라크와 같은 형태학적으로 구별되는 Aβ 플라크는 다른 종래의 아밀로이드 결합 염료7보다더 효율적으로 Cur에 의해 표지될 수 있다. 전반적으로, Cur는 Aβ 특이적 항체에 대한 신뢰할 수 있는 대안으로서 AD 동물 모델 및/또는 인간 AD 조직에서 의 사후 뇌 조직에 라벨 및 이미지 Aβ 플라크를 쉽고 저렴한 방법으로 적용할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 가설은 Cur가 다른 고전적인 아밀로이드 결합 염료뿐만 아니라 Aβ 특이적 항체와 비교했을 때 사후 AD 뇌 조직에서 Aβ 플라크를 라벨화하고 이미지화하는 가장 빠르고, 쉽고, 가장 저렴한 방법으로 사용될 수 있다는 것이었습니다. 본 연구의 목적은 사후 AD 뇌 조직에서 Cur에 의해 Aβ 플라크에 라벨을 부착하고 이미지화하는 데 필요한 최소 시간을 결정하고 Cur가 Aβ 플라크 라벨링을 위한 Aβ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 결과에 대한 지원은 세인트 메리의 승천에 필드 신경 과학 연구소에서 왔다.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1×70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
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