Summary

Doğal Polifenol Curcumin Kullanarak Beyin Dokusunda Amiloid Plakların Etiketlenmesi ve Görüntülenmesi

Published: November 01, 2019
doi:

Summary

Kurkumin, amiloid beta proteinine tercihli bağlanması ve diğer geleneksel amiloid bağlayıcı boyalarla yapısal benzerlikleri nedeniyle beyin dokusundaki amiloid beta protein plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi için ideal bir florofordur. Amiloid beta protein plaklarını geleneksel yöntemlere göre daha verimli ve ucuz bir şekilde etiketlemek ve hayal etmek için kullanılabilir.

Abstract

Amiloid beta proteininin (Aβ) ekstra ve hücre içi alanlarda birikintisi Alzheimer hastalığının (AD) ayırt edici patolojilerinden biridir. Bu nedenle, AD beyin dokusunda Aβ varlığının tespiti AD ilerlemesini önlemek için yeni tedaviler geliştirmek için değerli bir araçtır. Ad beyin dokusunda Aβ histokimyasal olarak saptanmak için çeşitli klasik amiloid bağlayıcı boyalar, florokrom, görüntüleme probları ve Aβ’ya özgü antikorlar kullanılmıştır. Aβ tespiti için bu bileşiklerin kullanımı maliyetli ve zaman alıcıdır. Ancak, yoğun floresan aktivitesi, yüksek afinite ve Aβ özgüllüğü ve geleneksel amiloid bağlayıcı boyalar ile yapısal benzerlikler nedeniyle, curcumin (Cur) postmortem aβ plakların etiketlenmesi ve görüntülenmesi için umut verici bir adaydır beyin dokusu. Bu bitki Curcuma longadoğal bir polifenol olduğunu. Bu çalışmada Cur, 5x ailesel Alzheimer hastalığının genetik fare modeli (5xFAD) ve insan AD dokusundan bir dakika içinde aβ plaklarını histokimyasal olarak etiketlemek için kullanılmıştır. Cur’un etiketleme yeteneği, tioflavin-S (Thio-S), Kongo kırmızısı (CR) ve Floro-yeşim C (FJC) gibi geleneksel amiloid bağlayıcı boyalarla ve Aβ’ya özgü antikorlarla (6E10 ve A11) karşılaştırıldı. Cur’un bu geleneksel boyalarla karşılaştırıldığında Aβ plaklarını etiketlemenin ve imajanın en ucuz ve en hızlı yolu olduğunu ve Aβ’ya özgü antikorlarla karşılaştırılabilir olduğunu gözlemledik. Buna ek olarak, Cur oligomerler ve fibriller gibi çoğu Aβ türü ile bağlanır. Bu nedenle Cur, Aβ plakları için en uygun maliyetli, basit ve hızlı florokrom algılama ajanı olarak kullanılabilir.

Introduction

Alzheimer hastalığı (AD) en yaygın biridir, yaşa bağlı, ilerleyici nörolojik bozukluklar ve ölüm önde gelen nedenlerinden biri dünya çapında1,2. Öğrenme, hafıza ve biliş bozukluğu, nöropsikiyatrik bozukluklar ile birlikte, yaygın belirtiler AD3tezahür vardır. AD’nin etiyolojisi tam olarak açıklanmamakla birlikte, mevcut genetik, biyokimyasal ve deneysel kanıtlar Aβ’nın kademeli birikiminin AD4için kesin bir biyobelirteç olduğunu göstermektedir. Bu yanlış katlanmış protein hücre içi ve hücre dışı alanlarda birikir ve sinaptik kaybı dahil olduğu düşünülmektedir, artan nöroinflamasyon, ve beyinde kortikal ve hipokampal bölgelerde nörodejenerasyon AD etkilenen5. Bu nedenle, AD dokusunda Aβ histochemical tespiti AD ilerlemesini önlemek için toksik olmayan, anti-amiloid ilaçların geliştirilmesinde önemli bir ilk adımdır.

Son birkaç on yıl içinde, birçok araştırma laboratuarı tarafından beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemek ve görüntülemek için çeşitli boyalar ve antikorlar kullanılmıştır, ancak bu yöntemlerden bazıları zaman alıcıdır ve kullanılan boyalar veya antikorlar pahalıdır ve birkaç aksesuar gerektirir. Kimyasal. Bu nedenle, AD beyninde Aβ plakların tespit ucuz bir araç geliştirilmesi hoş bir yeni araç olacaktır. Birçok laboratuvar cur kullanmaya başladı, umut verici bir anti-amiloid doğal polifenol, etiketleme ve görüntüleme Aβ için, yanı sıra AD için bir terapötik ajan6,7,8,9. Hidrofobikliği ve lipofilik yapısı, klasik amiloid bağlayıcı boyalarla yapısal benzerlikleri, güçlü floresan aktivitesi ve Aβ ile bağdaştırılan güçlü yakınlığı, Aβ dokudaki Aβ plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi için ideal bir florofon yapar10 . Aβ-plaklar ve oligomerler ile cur bağlanır ve varlığı da hücre içi alanlarda tespit edilir7,11,12,13. Buna ek olarak, bu minimal miktarda (1−10 nM) Cur 5x ailesel Alzheimer hastalığı (5xFAD) beyin dokusu nda Aβ plaklar etiket olabilir gösterilmiştir7. 1 nM konsantrasyonu Aβ plakların sayımı için optimum floresan yoğunluğunu sağlamasa da, 10 nM veya daha yüksek cur konsantrasyonu yapar. Ran ve meslektaşları14 gibi düşük dozlarda 0.2 nM difluoroboron-türevleştirilmiş Cur olarak yaklaşık bir kızılötesi prob in vivo Aβ mevduat tespit edebilirsiniz bildirdi. Bu dozun dokudaki Aβ plaklarını etiketlemek için yeterli olup olmadığı henüz belli değildir. Daha önceki çalışmaların çoğunda Cur kullanarak Aβ plaklarını boyamak için 20−30 dk kullanılmıştır, ancak optimal boyama çok daha az zaman gerektirebilir.

Bu çalışma, Cur’un AD beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemek için gerekli olduğu minimum süreyi test etmek ve Cur ile diğer konvansiyonel ile boyandıktan sonra 5xFAD farelerinden beyin dokusundaki Aβ plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi hassasiyetini karşılaştırmak için tasarlanmıştır. Thioflavin-S (Thio-S), Kongo kırmızısı (CR) ve Floro-yeşim C (FJC) gibi aβ bağlayıcı boyalar. Bu klasik amiloid bağlayıcı boyaların Aβ etiketleme yeteneği, 5xFAD farelerinden parafin gömülü ve kriyostat koronal beyin kesitlerinde ve yaşlı uyumlu insan AD ve kontrol beyin dokusundan Cur boyama ile karşılaştırıldı. Bulgular, Cur’un Aβ plaklarını Aβ spesifik antikorlara (6E10) benzer ve Thio-S, CR veya FJC’den orta derecede daha iyi bir şekilde etiketlediğini göstermektedir. Buna ek olarak, 5xFAD fareler için Cur intraperitoneal enjeksiyonları 2−5 gün boyunca uygulandığında, kan-beyin bariyerini geçti ve Aβ plaklar ile bağlı7. İlginçtir, Cur nanomolar konsantrasyonları etiketleme kupuran ve görüntü Aβ plaklar 5xFAD beyin dokusu7,14. Ayrıca, çekirdek, neuritik, diffüz ve yanmış plaklar gibi morfolojik olarak farklı Aβ plaklar Cur tarafından diğer konvansiyonel amiloid bağlayıcı boyalardan daha verimli olarak etiketlenebilir7. Genel olarak Cur, Ad hayvan modellerinden ve/veya insan AD dokusundan postmortem beyin dokusundaki Aβ plaklarını, Aβ’ya özgü antikorlara güvenilir bir alternatif olarak kolay ve ucuz bir şekilde etiket ve görüntü ye uygulanabilir.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler Saginaw Valley State University Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. İnsan dokusu Arizona Banner Sun Sağlık Enstitüsü’nde kurulmuş bir beyin bankası elde edildi15,16. 1. Hayvanların perfüzyonu Fiksatif ve perfüzyon tamponlarını hazırlayın. 80 g sodyum klorür (NaCl), 2 g potasyum klorür (KCl), 21,7 g disodyum hidrojen fosfat (Na…

Representative Results

Curcumin bir dakika içinde Aβ plakları etiketler. Cur ile 5xFAD dokusunu boyadığımızda, Cur etiketia Aβ plaklarının 1 dk içinde olduğunu bulduk. Cur ile artan kuluçka süresi Aβ plaklarının floresan yoğunluğunu biraz artırsa da, gözlenen Aβ plaklarının sayısı 1 dk ile 5 dk boyama süresi arasında anlamlı olarak farklı değildi(Şekil 1). Cur, aβ plaklarını kriyostat-ha…

Discussion

Hipotezimiz, Cur’un diğer klasik amiloid bağlayıcı boyalarla karşılaştırıldığında postmortem AD beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemenin ve iletmenin en hızlı, en kolay ve en ucuz yolu olarak kullanılabileceğini ve aβ’ya özgü antikorlar olabileceğini ileri sürüyordu. Bu çalışmanın amacı, Postmortem AD beyin dokusunda Cur tarafından Aβ plaklarının etiketlenip görüntülemesi için gereken minimum süreyi belirlemek ve Cur’un Aβ plaklarını etiketlemek için Aβ antikora alternatif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma için destek St Mary’s Yükselişi Alan Nörobilimler Enstitüsü geldi.

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol VWR,Radnor, PA
Alexa 594 Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10 Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11 Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope Olympus, Shinjuku, Japan Olympus BX51
Congo red Sigma, St. Louis, MO
Cryostat GMI, Ramsey, MN LeicaCM1800
Curcumin Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene BDH, Dawsonville, GA
Filter papers Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342 Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope Leica, Buffalo Grove, IL Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope Olympus, Shinjuku, Japan Olympus 1×70
Normal goat serum Sigma, St. Louis, MO
Paraffin Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100 Sigma, St. Louis, MO
Xylene VWR,Radnor, PA

References

  1. Cummings, J. L. Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
  2. Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer’s disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
  3. Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
  4. Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
  5. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
  6. Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer’s disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
  7. Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer’s disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
  8. Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
  9. Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer’s Disease. , (2017).
  10. den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer’s disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
  11. Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer’s disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
  12. Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer’s disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
  13. Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer’s patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
  14. Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
  15. Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
  16. Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
  17. Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer’s beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
  18. Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
  19. Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer’s brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
  20. Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
  21. Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
  22. Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
  23. Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
  24. Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
  25. Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).

Play Video

Cite This Article
Maiti, P., Plemmons, A., Bowers, Z., Weaver, C., Dunbar, G. Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin. J. Vis. Exp. (153), e60377, doi:10.3791/60377 (2019).

View Video