Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen
Summary
Dit protocol werd gegenereerd als een middel om hersenorganoïden te produceren in een vereenvoudigde, goedkope manier zonder exogene groeifactoren of kelder membraan matrix met behoud van de diversiteit van de hersenen cel types en vele kenmerken van cellulaire organisatie.
Abstract
Menselijke hersenorganoïden onderscheiden van embryonale stamcellen bieden de unieke kans om ingewikkelde interacties van meerdere celtypen in een driedimensionaal systeem te bestuderen. Hier presenteren we een relatief eenvoudige en goedkope methode die hersenorganoïden oplevert. In dit protocol worden menselijke pluripotente stamcellen opgesplitst in kleine clusters in plaats van enkele cellen en gekweekt in basismedia zonder een heterologe keldermembraanmatrix of exogene groeifactoren, waardoor de intrinsieke ontwikkelingssignalen de vorm kunnen geven aan de de groei van organoïde. Dit eenvoudige systeem produceert een diversiteit aan hersenceltypes, waaronder glia- en microgliale cellen, stamcellen en neuronen van de voorhersenen, midhersenen en achterhersenen. Organoïden gegenereerd uit dit protocol tonen ook kenmerken van de juiste temporele en ruimtelijke organisatie aangetoond door brightfield beelden, histologie, immunofluorescentie en real-time kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie ( qRT-PCR). Omdat deze organoïden celtypen uit verschillende delen van de hersenen bevatten, kunnen ze worden gebruikt voor het bestuderen van een veelheid aan ziekten. Bijvoorbeeld, in een recent document toonden we het gebruik van organoïden gegenereerd uit dit protocol voor het bestuderen van de effecten van hypoxie op het menselijk brein. Deze aanpak kan worden gebruikt om een scala van anders moeilijk te bestuderen aandoeningen zoals neurodevelopmental handicaps, genetische aandoeningen, en neurologische ziekten te onderzoeken.
Introduction
Als gevolg van talloze praktische en ethische beperkingen, is er een groot deel van de moeite bij het bestuderen van het menselijk brein. Terwijl studies met behulp van knaagdieren zijn van cruciaal belang voor ons begrip van het menselijk brein, de muis hersenen heeft veel verschillen1,2. Interessant is dat muizen een neuronale dichtheid hebben die minstens 7 keer minder is dan de primatenhersenen3,4. Hoewel primaten zijn dichter bij de mens dan knaagdieren vanuit een evolutionair oogpunt, is het niet praktisch voor de meeste onderzoekers om te werken met hen. Het doel van dit protocol was om vele belangrijke kenmerken van het menselijk brein samen te vatten met behulp van een vereenvoudigde en minder dure methode zonder de noodzaak van een heterologe kelder membraan matrix of exogene groeifactoren met behoud van de hersenen cel diversiteit en cellulaire organisatie.
Formatief werk van het Sasai-lab gebruikte de serumvrije kweek van embryoïde lichamen (SFEBq) methode om twee- en driedimensionale neuronale celtypen te genereren uit gesignaleerde embryonale stamcellen (EsCs)5,6. Veel menselijke hersenorganoïde methoden hebben een relatief vergelijkbaar pad gevolgd van gesignaleerde SER’s7,8. In tegenstelling, dit protocol begint met clusters van vrijstaande menselijke EsCS (hESCs), vergelijkbaar met de eerste stappen van het baanbrekende werk van de Thomson en Zhang laboratoria voorafgaand aan de beplating stappen9,10 evenals de eerste stap van de hersenen organoïde protocol van het Pasca laboratorium vóór de toevoeging van exogene groeifactoren11. Kelder membraan matrices (bijvoorbeeld matrigel) zijn gebruikt in vele hersenen organoïde protocollen en het is aangetoond dat een effectieve steiger8. Echter, meest gebruikte kelder membraan matrices komen niet zonder complicaties als ze co-zuiveren met onbekende hoeveelheden groeifactoren met batch tot batch variabiliteit tijdens de productie12. Bovendien kunnen deze matrices beeldvorming bemoeilijken en het risico op besmetting en kosten verhogen.
Terwijl menselijke hersenorganoïden kunnen worden gebruikt om veel vragen te beantwoorden, zijn er bepaalde beperkingen om in gedachten te houden. Voor een, uitgaande van embryonale stamcellen, organoïden lijken meer op onrijpe hersenen dan oude hersenen en als zodanig misschien niet ideale modellen voor ziekten die zich voordoen op oudere leeftijd, zoals de ziekte van Alzheimer. Ten tweede, terwijl ons protocol markers van voorhersenen, midbrain en hindbrain ontwikkeling gevonden die nuttig zijn om het effect van een behandeling of ziekte op cellen uit meerdere hersengebieden in overleg te bestuderen, andere protocollen kunnen worden gevolgd om zich te concentreren op specifieke hersengebieden13,14. Ten slotte is een andere beperking van organoïde modellen die van grootte, terwijl de gemiddelde lengte van een menselijk brein ongeveer 167 mm, hersenorganoïden gemaakt met het gebruik van agitatie groeien tot 4 mm8 en de organoïden gevormd door dit protocol groeien tot 1-2 mm door 10 weken. Niettemin, dit protocol biedt een belangrijk instrument om menselijk hersenweefsel en de interactie van meerdere celtypes te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Net als bij andere organoïde modellen, dit is een kunstmatig systeem dat wordt geleverd met verschillende kanttekeningen. Hoewel er weinig batch aan partijvariatie in termen van algemene uitdrukkingsniveaus was, stelden de individuele organoïden verschillen tentoon. Zo was de locatie van Sox-2 positieve gebieden niet identiek in elke organoïde (figuur 3). Terwijl qPCR is geschikt om te zoeken naar algemene veranderingen in batches van cellen, extra technieken zoals eencellige RNAseq zal worden gebruik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Yale Stem Cell Core (YSCC), en het Yale Cancer Center (YCC) voor hulp. We danken Dr. Jung Kim voor zijn neuropathologie beoordeling. Dit werk werd ondersteund door Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, en NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), het Yale Cancer Center en het Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) en een royale onbeperkte gift van Joseph en Lucille Madri.
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
