Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen
Summary
Dieses Protokoll wurde als Mittel zur Herstellung von Gehirnorganoiden in einer vereinfachten, kostengünstigen Weise ohne exogene Wachstumsfaktoren oder Kellermembranmatrix unter Beibehaltung der Vielfalt der Gehirnzelltypen und vieler Merkmale der zellulären Organisation erzeugt.
Abstract
Organoide des menschlichen Gehirns, die sich von embryonalen Stammzellen unterscheiden, bieten die einzigartige Möglichkeit, komplizierte Wechselwirkungen mehrerer Zelltypen in einem dreidimensionalen System zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine relativ einfache und kostengünstige Methode, die Hirnorganoide ergibt. In diesem Protokoll werden menschliche pluripotente Stammzellen in kleine Cluster anstelle von Einzelzellen aufgebrochen und in Basismedien ohne heterologe Kellermembranmatrix oder exogene Wachstumsfaktoren angebaut, so dass die intrinsischen Entwicklungshinweise die Organoidwachstum. Dieses einfache System produziert eine Vielzahl von Gehirnzelltypen, einschließlich Glia- und Mikrogliazellen, Stammzellen und Neuronen des Vorderhirns, des Mittelhirns und des Hinterhirns. Organoide, die aus diesem Protokoll generiert werden, zeigen auch Merkmale einer angemessenen zeitlichen und räumlichen Organisation, die durch Hellfeldbilder, Histologie, Immunfluoreszenz und quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit demonstriert wird ( qRT-PCR). Da diese Organoide Zelltypen aus verschiedenen Teilen des Gehirns enthalten, können sie für das Studium einer Vielzahl von Krankheiten verwendet werden. Zum Beispiel haben wir in einem kürzlich erschienenen Papier die Verwendung von Organoiden demonstriert, die aus diesem Protokoll für die Untersuchung der Auswirkungen von Hypoxie auf das menschliche Gehirn generiert wurden. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um eine Reihe von ansonsten schwer zu untersuchenden Bedingungen wie neuroentwicklungsbedingten Handicaps, genetischestörungen und neurologischen Erkrankungen zu untersuchen.
Introduction
Aufgrund unzähliger praktischer und ethischer Einschränkungen gab es große Schwierigkeiten, das menschliche Gehirn zu studieren. Während Studien mit Nagetieren waren entscheidend für unser Verständnis des menschlichen Gehirns, die Maus Gehirn hat viele Unterschiede1,2. Interessanterweise haben Mäuse eine neuronale Dichte, die mindestens 7 mal kleiner ist als das Primatenhirn3,4. Obwohl Primaten dem Menschen aus evolutionärer Sicht näher sind als Nagetiere, ist es für die meisten Forscher nicht praktikabel, mit ihnen zu arbeiten. Der Zweck dieses Protokolls war es, viele wichtige Merkmale des menschlichen Gehirns mit einer vereinfachten und kostengünstigeren Methode zu rekapitulieren, ohne dass eine heterologe Kellermembranmatrix oder exogene Wachstumsfaktoren erforderlich sind, während die Vielfalt der Gehirnzellen und die zelluläre Organisation erhalten bleiben.
Die formative Arbeit des Sasai-Labors verwendete die serumfreie Kultur der embryoiden Körper (SFEBq) Methode, um zwei- und dreidimensionale neuronale Zelltypen aus signalisierten embryonalen Stammzellen (ESCs) zu erzeugen5,6. Viele organoide Methoden des menschlichen Gehirns haben einen relativ ähnlichen Weg von signalisierten ESCs7,8verfolgt. Im Gegensatz dazu beginnt dieses Protokoll mit Clustern von abgetrennten menschlichen ESCs (hESCs), ähnlich den ersten Schritten der bahnbrechenden Arbeit der Laboratorien Thomson und Zhang vor den Beschichtungsschritten9,10 sowie dem ersten Schritt des Hirnorganoidprotokolls des Pasca-Labors vor der Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren11. Kellermembranmatrizen (z.B. Matrigel) wurden in vielen Organoidprotokollen des Gehirns verwendet und es hat sich als ein effektives Gerüst8gezeigt. Jedoch, am häufigsten verwendete Keller Membranmatrizen kommen nicht ohne Komplikationen, da sie mit unbekannten Mengen von Wachstumsfaktoren mit Charge zu Charge Variabilität während der Produktion12mitreinigen. Darüber hinaus können diese Matrizen die Bildgebung erschweren und das Risiko von Kontamination und Kosten erhöhen.
Während menschliche Gehirn-Organoide verwendet werden können, um viele Fragen zu beantworten, Gibt es gewisse Einschränkungen zu beachten. Zum einen ähneln Organoide, ausgehend von embryonalen Stammzellen, unreifen Gehirnen eher als gealterte Gehirne und sind daher möglicherweise keine idealen Modelle für Krankheiten, die im Alter auftreten, wie die Alzheimer-Krankheit. Zweitens, während unser Protokoll Marker der Vor-, Hirn- und Hinterhirnentwicklung gefunden hat, die nützlich sind, um die Wirkung einer Behandlung oder Krankheit auf Zellen aus mehreren Hirnregionen gemeinsam zu untersuchen, können andere Protokolle befolgt werden, um sich auf bestimmte Hirnregionen zu konzentrieren13,14. Schließlich ist eine weitere Einschränkung der Organoid-Modelle die der Größe, während die durchschnittliche Länge eines menschlichen Gehirns etwa 167 mm, Gehirn-Organoide mit der Verwendung von Agitation wachsen bis zu 4 mm8 und die Organoide durch dieses Protokoll gebildet wachsen bis 1-2 mm von 10 Wochen. Dennoch bietet dieses Protokoll ein wichtiges Werkzeug, um menschliches Gehirngewebe und die Interaktion mehrerer Zelltypen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ähnlich wie bei anderen Organoidmodellen ist dies ein künstliches System, das mit mehreren Einschränkungen einhergeht. Obwohl es in Bezug auf die Gesamtexpressionsniveaus nur geringe Batch-zu-Batch-Variationen gab, zeigten einzelne Organoide Unterschiede. Beispielsweise war die Position der Sox-2-positiven Bereiche nicht in jedem Organoid identisch (Abbildung 3). Während qPCR geeignet ist, nach allgemeinen Veränderungen in Zellchargen zu suchen, werden zusätzliche Techniken wie single cell RNAseq i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Yale Stem Cell Core (YSCC) und dem Yale Cancer Center (YCC) für die Unterstützung. Wir danken Dr. Jung Kim für seine neuropathologische Rezension. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, und NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), dem Yale Cancer Center und dem Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) und einem großzügigen, uneingeschränkten Geschenk von Joseph und Lucille Madri.
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
