Une méthode statique auto-dirigée pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines
Summary
Ce protocole a été généré comme un moyen de produire des organoïdes cérébraux d’une manière simplifiée et peu coûteuse sans facteurs de croissance exogènes ou matrice de membrane de sous-sol tout en maintenant la diversité des types de cellules cérébrales et de nombreuses caractéristiques de l’organisation cellulaire.
Abstract
Les organoïdes du cerveau humain différenciés des cellules souches embryonnaires offrent l’occasion unique d’étudier des interactions compliquées de plusieurs types de cellules dans un système tridimensionnel. Ici nous présentons une méthode relativement simple et peu coûteuse qui donne des organoïdes de cerveau. Dans ce protocole, les cellules souches pluripotentes humaines sont divisées en petits groupes au lieu de cellules simples et cultivées dans des médias de base sans matrice hétérologue de membrane de sous-sol ou facteurs de croissance exogènes, permettant aux indices développementaux intrinsèques de façonner le croissance de l’organoïde. Ce système simple produit une diversité de types de cellules cérébrales, y compris les cellules gliales et microgliales, les cellules souches et les neurones du cerveau avant, du cerveau moyen et du cerveau postérieur. Les organoïdes générés à partir de ce protocole présentent également des caractéristiques d’organisation temporelle et spatiale appropriée démontrées par des images de champ lumineux, l’histologie, l’immunofluorescence et la réaction en chaîne quantitative de transcription inverse en temps réel de polymérase de polymérase ( qRT-PCR). Parce que ces organoïdes contiennent des types de cellules de diverses parties du cerveau, ils peuvent être utilisés pour étudier une multitude de maladies. Par exemple, dans un article récent, nous avons démontré l’utilisation d’organoïdes générés par ce protocole pour étudier les effets de l’hypoxie sur le cerveau humain. Cette approche peut être utilisée pour étudier un éventail de conditions autrement difficiles à étudier telles que les handicaps neurodéveloppementaux, les troubles génétiques et les maladies neurologiques.
Introduction
En raison d’une myriade de limitations pratiques et éthiques, il y a eu beaucoup de difficulté à étudier le cerveau humain. Alors que les études utilisant des rongeurs ont été essentiels à notre compréhension du cerveau humain, le cerveau de la souris a de nombreuses différences1,2. Fait intéressant, les souris ont une densité neuronale qui est au moins 7 fois moins que le cerveau des primates3,4. Bien que les primates soient plus proches des humains que des rongeurs d’un point de vue évolutif, il n’est pas pratique pour la plupart des chercheurs de travailler avec eux. Le but de ce protocole était de récapituler beaucoup de dispositifs importants du cerveau humain utilisant une méthode simplifiée et moins chère sans avoir besoin d’une matrice hétérologue de membrane de sous-sol ou de facteurs de croissance exogènes tout en maintenant la diversité de cellules de cerveau et l’organisation cellulaire.
Les travaux de formation du laboratoire Sasai ont utilisé la culture sans sérum des corps embryonnaires (SFEBq) méthode pour générer des types de cellules neuronales à deux et trois dimensions à partir de cellules souches embryonnaires signalisées (ESC)5,6. Beaucoup de méthodes organoïdes du cerveau humain ont suivi un chemin relativement similaire à partir de CES signalés7,8. En revanche, ce protocole commence par des grappes d’ESC humains détachés (HESC), semblables aux premières étapes des travaux séminals des laboratoires Thomson et Zhang avant les étapes de placage9,10 ainsi que l’étape initiale du protocole organoïde du cerveau du laboratoire Pasca avant l’ajout de facteurs de croissance exogènes11. Des matrices de membrane de sous-sol (p. ex., matrigel) ont été utilisées dans de nombreux protocoles organoïdes du cerveau et il a été démontré qu’il s’agit d’un échafaudage efficace8. Cependant, les matrices de membrane de sous-sol les plus couramment utilisées ne viennent pas sans complications car elles co-purifie avec des quantités inconnues de facteurs de croissance avec la variabilité de lot à lot pendant la production12. De plus, ces matrices peuvent compliquer l’imagerie et augmenter le risque de contamination et de coût.
Alors que les organoïdes du cerveau humain peuvent être utilisés pour répondre à de nombreuses questions, il ya certaines limites à garder à l’esprit. D’une part, à partir de cellules souches embryonnaires, les organoïdes ressemblent plus étroitement aux cerveaux immatures qu’aux cerveaux âgés et, en tant que tels, ne sont peut-être pas des modèles idéaux pour les maladies qui surviennent chez la vieillesse, comme la maladie d’Alzheimer. Deuxièmement, alors que notre protocole a trouvé des marqueurs de développement du cerveau antérieur, du cerveau moyen et du cerveau postérieur qui sont utiles pour étudier l’effet d’un traitement ou d’une maladie sur les cellules de plusieurs régions du cerveau de concert, d’autres protocoles peuvent être suivis pour se concentrer sur des régions spécifiques du cerveau13,14. Enfin, une autre limitation des modèles organoïdes est celle de la taille, alors que la longueur moyenne d’un cerveau humain d’environ 167 mm, les organoïdes cérébraux fabriqués avec l’utilisation de l’agitation poussent jusqu’à 4 mm8 et les organoïdes formés par ce protocole se développent à 1-2 mm par 10 semaines. Néanmoins, ce protocole fournit un outil important pour étudier le tissu cérébral humain et l’interaction de plusieurs types de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Semblable à d’autres modèles organoïdes, il s’agit d’un système artificiel qui vient avec plusieurs mises en garde. Bien qu’il y ait eu peu de variation de lot à lot en termes de niveaux d’expression globaux, les organoïdes individuels ont montré des différences. Par exemple, l’emplacement des zones positives Sox-2 n’était pas identique dans tous les organoïdes (figure 3). Bien que qPCR soit approprié pour rechercher des changements globaux dans des lots de cellules, des techniqu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Yale Stem Cell Core (YSCC) et le Yale Cancer Center (YCC) pour leur aide. Nous remercions le Dr Jung Kim pour son examen de neuropathologie. Ce travail a été soutenu par Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, et NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), le Yale Cancer Center et le Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) et un généreux don sans restriction de Joseph et Lucille Madri.
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
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