फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा एस्परगिलस फ्यूमिगटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मापना
Summary
यह प्रोटोकॉल फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मानव प्राथमिक फैगोसाइट्स द्वारा एस्परगिलस फ्यूमिगेटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मात्रात्मक रूप से मापने और केवल आसंजन से ल्यूकोसाइट्स तक कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को भेदभाव करने के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है।
Abstract
मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगाटस द्वारा इनवेसिव पल्मोनरी संक्रमण इम्यूनोसमझौता रोगियों के लिए एक बड़ा खतरा बन गया है। साँस कवक कोनिडिया (बीजाणु) मानव फेफड़ों के अल्वेली से सहज मोनोसाइट्स और/या न्यूट्रोफिल द्वारा फैगोसाइटोस किए जाने से साफ हो जाते हैं । यह प्रोटोकॉल फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइट (एफईसी) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फागोसाइटोसिस का एक तेज और विश्वसनीय माप प्रदान करता है- मानव ल्यूकोसाइट्स के साथ सह-ऊष्मायन के लिए कोनिडिया लेबल और बाद में एक एंटी-फिटेक एंटीबॉडी के साथ प्रतिधुंधला करने के लिए आंतरिक और सेल-अनुयायी कोनिडिया के भेदभाव की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे इसकी तेजी, ब्याज के अन्य सेल मार्कर के साइटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ परख को संयोजित करने की संभावना, एक ही नमूने से मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल का एक साथ विश्लेषण और अन्य सेल दीवार-असर कवक या बैक्टीरिया के लिए इसकी प्रयोज्यता है। रोगोकोसाइट्स के प्रतिशत का निर्धारण रोगाणु की उग्रता का मूल्यांकन करने या रोगजनक वाइल्डटाइप और म्यूटेंट की तुलना करने के साथ-साथ रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए मानव ल्यूकोसाइट क्षमताओं की जांच के लिए इम्यूनोलॉजिस्ट के लिए माइक्रोबायोलॉजिस्ट को एक साधन प्रदान करता है।
Introduction
इनवेसिव पल्मोनरी एस्परगिलोसिस इम्यूनोमोडिएग किए गए रोगियों के लिए एक बड़ा खतरा है क्योंकि उपचार विकल्प सीमित हैं और केवल प्रारंभिक निदान पर सफल होते हैं, जिससे उच्च मृत्यु दर1हो जाती है। संक्रामक एजेंट मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगाटस के कोनिडिया (बीजाणु) हैं जो अधिकांश आवासों के लिए सर्वव्यापीहैं। कोनिडिया साँस ले रहे हैं, वायुमार्ग के माध्यम से गुजरती हैं और अंत में फेफड़ों के अल्वेली में प्रवेश कर सकती हैं। इम्यूनोसक्षम मनुष्यों में, इन कोनिडिया को जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे मोनोसाइट्स या मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल ग्रैनुलोसाइट्स द्वारा साफ किया जाता है, जो (फागोसाइटोज) लेते हैं और रोगजनकोंको पचातेहैं 3। मेजबान-रोगजनक बातचीत में रुचि होने पर माइक्रोबायोलॉजिस्ट और इम्यूनोलॉजिस्ट के लिए Phagocytosis महत्वपूर्ण है। टकराव के परख, जैसे ल्यूकोसाइट्स और कोनिडिया का सह-ऊष्मायन, अक्सर फ्लोरोसेइन या इसके डेरिवेटिव फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफईसी) द्वारा बीजाणुओं की लेबलिंग शामिल है। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, आंतरिक फ्लोरोसेंट कोनिडिया की पहचान करना और संलग्न/अनुयायी कोनिडिया निर्धारित करना सीधा है, हालांकि यह दृष्टिकोण बोझिल है और वास्तविक रूप से कुछ सैकड़ों कोशिकाओं तक सीमित है4। हालांकि, प्रवाह साइटोमेट्री में जो आसानी से मिनटों के भीतर सैकड़ों हजारों कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है, फागोसाइटोस और अनुयायी कोनिडिया का अंतर बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, कई प्रोटोकॉल ट्राइपैन ब्लू पर भरोसा करते हैं ताकि वह पालन करनेवाले5, 6,7,8से फिटेक-फ्लोरेसेंस को बुझा सके। एक अन्य दृष्टिकोण एहिडियम ब्रोमाइड और फिटेक के फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण का शोषण कर रहा है ताकि वे अनुयायी कोनिडिया9,10,11से हरे रंग के फ्लोरेसेंस के बजाय लाल रंग का उत्सर्जन कर सके । यदि विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, जैसा कि कुछ बैक्टीरिया के लिए मामला है, तो सेल-बाउंड कणों को सीधे12,13दाग दिया जा सकता है।
यहां, हम एक एंटी-फिटिक एंटीबॉडी के साथ-साथ कोशिकाओं को बीजाणुओं के लगाव और बातचीत की कमी के साथ मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा एफईसी-लेबल ए फ्यूमिगेटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस का जल्दी और मात्रात्मक आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। विधि आगे के सेल मार्कर के एक साथ प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए भी अनुमति देती है जिसे एक ही नमूने से मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल द्वारा फागोसाइटोसिस के अलग विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल कवक उपभेदों के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यहां प्रस्तुत जीनस मुकोरल्स से एस्परगिलस की कई प्रजातियां और अन्य मोल्ड) और उनके म्यूटेंट14 और फागोसाइट्स पर इम्यूनोलॉजिकल रिसर्च, जैसे इम्यूनोसमझौता व्यक्तियों से ल्यूकोसाइट्स।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल बड़ी संख्या में प्राथमिक मानव ल्यूकोसाइट्स के साथ ए फ्यूमिगाटस कोनिडिया की बातचीत को मापने के लिए एक तेज प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि प्रस्तुत करता है जो आम सूक्ष्म प्रोटोकॉल में संभव न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए श्रीमती पिया Stier शुक्रिया अदा करते हैं । एम वॉन लिलिएनफेल्ड-टॉल को केंद्र द्वारा सेप्सिस कंट्रोल एंड केयर (जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ एजुकेशन एंड हेल्थ, बीएमबीएफ, एफकेजेड 01E01002) और इंफेनोग्नोस्टिक्स रिसर्च कैंपस (बीएमबीएफ, एफकेजेड 13GW0096D) द्वारा समर्थित किया जाता है। थी Ngoc माई होआंग माइक्रोबियल कम्युनिकेशन के जेना स्कूल द्वारा समर्थित है (ड्यूश Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
