قياس كثرة الفندره من الرشاشيات تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية باستخدام تدفق الخلوي
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقه سريعة وموثوق بها لقياس كثرة المحببات من الرشاشيات التبخير كونيديا بواسطة الخلايا الاساسيه البشرية باستخدام التدفق الخلوي والتمييز بين ندره الكونيديا من مجرد التصاق إلى الكريات البيضاء.
Abstract
العدوى الرئوية الغازية من قبل العفن الرشاشيات التبخير يشكل تهديدا كبيرا للمرضي المناعي. يتم مسح الكونيديا الفطرية المستنشقة (الجراثيم) من الحويصلات الرئوية البشرية بواسطة الخلايا الفطرية و/أو العدلات. يوفر هذا البروتوكول قياسا سريعا وموثوقا به لندره الكريات بواسطة التدفق الخلوي باستخدام فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC)-المسمي كونيديا لاحتضان المشتركة مع الكريات البيضاء البشرية والمضادة اللاحقة مع الأضداد المناهضة لل FITC للسماح بالتمييز الداخلي والخلوي كونيديا. المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي توفر خدمه ، وامكانيه الجمع بين المقايسة مع تحليل الخلوية من علامات الخلية الأخرى من الفائدة ، والتحليل في وقت واحد من الخلايا الاحاديه والعدلات من عينه واحده وقابليتها للتطبيق علي الخلايا الأخرى التي تحمل الجدار الفطريات أو البكتيريا. تحديد النسب المئوية من الكريات البيضاء فاجوسيتوسينج يوفر وسيله لعلماء الاحياء المجهرية لتقييم ضراوة من الممرض أو للمقارنة بين الأنواع البرية الممرض والمسوخ وكذلك لعلماء المناعة للتحقيق في قدرات الكريات البيضاء البشرية لمكافحه مسببات الامراض.
Introduction
داء الرشاشيات الرئوي الغازي يشكل تهديدا كبيرا للمرضي الذين يعانون من نقص المناعة لان خيارات العلاج محدوده وناجحه فقط عند التشخيص المبكر ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفاات1. العوامل المعدية هي كونيديا (جراثيم) من العفن الرشاشيات التبخير التي هي في كل مكان إلى معظم الموائل2. كونيديا يتم استنشاقها ، تمر عبر الخطوط الجوية ويمكن ان تدخل في النهاية الحويصلات الهوائية الرئوية. في البشر المناعي ، يتم مسح هذه الكونيديا من قبل الخلايا المناعية الفطرية مثل الكريات الوحيدة أو الضامة والمحببة العدلات ، التي تتناول (فاجوسيتوسي) وهضم مسببات الامراض3. كثرة المحببات مهمة لعلماء الاحياء المجهرية وعلماء المناعة بالمثل عند المهتمين بالتفاعلات بين المضيف والممرض. اختبارات المواجهة ، مثل المشاركة في حضانة الكريات البيضاء والكونيديا ، وغالبا ما تشمل وضع العلامات من الجراثيم بواسطة فلوريسئين أو مشتقه فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC). باستخدام المجهر ، فمن الواضح لتحديد الكونيديا الفلورية المستوعبة وتحديد الكونيديا المرفقة/الملتصقة ، علي الرغم من ان هذا النهج هو مرهق ومقيد واقعيا إلى بضع مئات من الخلايا4. ومع ذلك ، في التدفق الخلوي الذي يسمح بسهوله تحليل مئات آلاف من الخلايا في غضون دقائق ، تلطيخ التفاضلية من الكونيديا والملتصقة أمر حيوي. ولذلك ، العديد من البروتوكولات تعتمد علي الترلون الأزرق لإخماد fitc-الفلورية من الكونيديا الملتصقة5،6،7،8. نهج آخر هو استغلال الطاقة بالرنين الفلوري نقل بروميد ايثيديوم و fitc لتنبعث منها الأحمر بدلا من الفلورية الخضراء من تمسك كونيديا9,10,11. إذا كانت الأجسام المضادة المحددة متوفرة ، كما هو الحال بالنسبة لبعض البكتيريا ، يمكن ان تكون الجزيئات المرتبطة بالخلايا ملطخه مباشره ب12،13.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتقييم بسرعة وكميه كثرة المحببات من FITC-المسمي ا. تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية جنبا إلى جنب مع المرفق من الجراثيم إلى الخلايا وعدم التفاعل من خلال توظيف الوفيكوسيانين (APC)-المضادة لل fitc الأجسام. كما يسمح الأسلوب للتحليل الخلوي تدفق في وقت واحد من علامات الخلية الأخرى التي يمكن استخدامها لتحليل منفصلة من كثرة الخلايا الاحاديه والعدلات من نفس العينة.
يمكن تطبيق البروتوكول لتوصيف سلالات الفطرية (علي سبيل المثال ، عده أنواع من الرشاشيات وغيرها من قوالب من جنس mucorales المقدمة هنا) والمسوخ بهم14 والبحوث المناعية علي البالعات ، مثل الكريات البيضاء من الافراد المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويقدم هذا البروتوكول طريقه تدفق سريع الخلوي لقياس التفاعل من ا. تبخير كونيديا مع عدد كبير من الكريات البيضاء البشرية الاساسيه التي ليس من الممكن في البروتوكولات المجهرية المشتركة. خلايا التصوير مع المجهر والعد يدويا كونيديا المستوعبة مرهقه ويمكن ان يتم واقعيا لبضع مئات من الخلايا ف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيدة بيا ستير علي المساعدة التقنية الممتازة. يتم دعم m. فون ليلينفيلد-Toal من قبل مركز التحكم في الانتان والرعاية (وزاره التعليم والصحة الاتحادية المانيه ، BMBF ، FKZ 01E01002) والحرم الجامعي للبحوث InfectoGnostics (BMBF ، FKZ 13GW0096D). ويدعم ثي نغوك ماي هوانغ من قبل مدرسه جينا للاتصالات الميكروبية (Deutsche Forschنجوجيميندينشافت ، FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
