Mätning av fagocytos av Aspergillus fumigatus conidia av humana leukocyter med flödescytometri
Summary
Detta protokoll ger en snabb och tillförlitlig metod för att kvantitativt mäta fagocytos av Aspergillus fumigatus conidia av humana primära fagocyter med flödescytometri och att diskriminera fagocytos av conidia från blotta vidhäftning till leukocyter.
Abstract
Invasiv lunginfektion av mögel Aspergillus fumigatus utgör ett stort hot mot patienter med nedsatt immunförsvar. Inhalerad svamp conidia (sporer) rensas från den mänskliga lung alveolerna genom att vara fagocyterade av medfödda monocyter och/eller neutrofiler. Detta protokoll erbjuder en snabb och tillförlitlig mätning av fagocytos genom flödescytometri med fluorescein isotiocyanat (FITC)-märkt conidia för co-inkubation med humana leukocyter och efterföljande motfärgning med en anti-FITC antikropp för att möjliggöra diskriminering av internaliserade och cell-anhängare av conidia. Stora fördelar med detta protokoll är dess rapidness, möjligheten att kombinera analysen med kors analys av andra cell markörer av intresse, den samtidiga analysen av monocyter och neutrofiler från ett enda prov och dess tillämplighet på andra cell vägg-bärande svampar eller bakterier. Bestämning av procentsatser av fagocytosing leukocyter ger ett sätt att mikrobiologer för utvärdering virulens av en patogen eller för att jämföra patogen vildtyper och mutanter samt Immunologer för att undersöka mänskliga leukocyt förmåga att bekämpa patogener.
Introduction
Invasiv pulmonell aspergillos är ett stort hot mot patienter med nedsatt immunförsvar eftersom behandlingsalternativ är begränsade och endast framgångsrika vid tidig diagnos, vilket leder till hög dödlighet1. Smittämnen är conidia (sporer) av mögel Aspergillus fumigatus som är allestädes närvarande till de flesta Habitat2. Conidia inhaleras, passera genom luftvägarna och kan slutligen komma in i lungorna alveoler. I immunkompetenta människor, dessa conidia rensas av medfödda immunceller såsom monocyter eller makrofager och neutrofila granulocyter, som tar upp (phagocytose) och smälta patogener3. Fagocytos är viktigt för mikrobiologer och Immunologer jämväl när intresserade av värd-patogenen interaktioner. Konfrontation analyser, såsom Co-inkubation av leukocyter och conidia, ofta omfattar märkning av sporer av fluorescein eller dess derivat fluorescein isotiocyanat (FITC). Med hjälp av ett mikroskop, är det enkelt att identifiera internaliserade fluorescerande conidia och för att bestämma bifogade/adherent conidia, även om detta tillvägagångssätt är besvärligt och realistiskt begränsad till några hundra av celler4. Men i flödescytometri som lätt tillåter analys av hundratusentals celler inom några minuter, är differentiell färgning av fagocytos och anhängare conidia avgörande. Därför förlitar sig många protokoll på trypan Blue för att släcka FITC-fluorescens från anhängare conidia5,6,7,8. En annan metod är att utnyttja fluorescensresonans energiöverföring av etidiumbromid bromid och FITC att avge rött i stället för grön fluorescens från anhängare conidia9,10,11. Om specifika antikroppar finns tillgängliga, vilket är fallet för vissa bakterier, kan cell bundna partiklar direkt färgas12,13.
Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt och kvantitativt bedöma fagocytos av FITC-märkt a. fumigatus conidia av humant leukocyter tillsammans med fastsättning av sporer till celler och bristande interaktion genom att anställa en allophycocyanin (APC)-kopplad anti-FITC antikropp. Metoden gör det också möjligt för samtidig flödescytometrisk analys av ytterligare cell markörer som kan användas för separat analys av fagocytos av monocyter och neutrofiler från samma prov.
Protokollet kan tillämpas för karakterisering av svampstammar (t. ex. flera arter av Aspergillus och andra formar från släktet Mucorales presenteras här) och deras mutanter14 och immunologisk forskning om fagocyter, såsom leukocyter från immunkomprometterade individer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll presenterar en snabbflödescytometrisk metod för att mäta interaktionen mellan a. fumigatus conidia med ett stort antal primära humana leukocyter som inte är möjligt i vanliga mikroskopiska protokoll. Imaging celler med ett mikroskop och manuellt räkna internaliserade conidia är besvärligt och kan realistiskt göras för några hundra celler bara. Flödescytometri övervinner detta problem genom att mäta tusentals celler inom några minuter. Ett hinder som är gemensamt för båda metode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Pia Stier för ett utmärkt tekniskt bistånd. M. von Lilienfeld-Toal stöds av centrum för sepsis kontroll och omsorg (tyska federala ministeriet för utbildning och hälsa, BMBF, FKZ 01E01002) och InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang stöds av Jena School of mikrobiell kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
