Summary

نقل وتوسيع الخلايا التائية الأولية في تسعة أيام مع الحفاظ على النمط الظاهري للذاكرة المركزية

Published: March 18, 2020
doi:

Summary

نحن نرسم بروتوكول لمدة 9 أيام لنقل وتوسيع خلايا الدم الأحادي النووي المحيطية rhesus المكاك الذي ينتج الخلايا مع التعبير المشترك الممتاز عن الجينات ذات الاهتمام في عدد كاف لدراسات التسريب من فعالية الخلية.

Abstract

غالبًا ما تنطوي العلاجات المناعية الناشئة لعلاج الأمراض المعدية والسرطانات على نقل مجموعات الخلايا مع ترميز البروتينات التي تستهدف الأمراض. على سبيل المثال، مستقبلات مستضد الايميريك (CAR)-T الخلايا لعلاج السرطانات والالتهابات الفيروسية تنطوي على نقل الخلايا التائية مع الجينات الاصطناعية ترميز جزيئات CAR. جزيئات جمهورية أفريقيا الوسطى جعل الخلايا التائية التعرف على وجه التحديد وقتل السرطان أو الخلايا المصابة فيروسي. كما يمكن أن تكون الخلايا مُنقلة مع جينات أخرى ذات أهمية. على سبيل المثال، يمكن أن يتم نقل الخلايا مع الجينات ترميز البروتينات التي تستهدف الخلايا إلى مواقع محددة. هنا، نقدم بروتوكولاً لتبديل الخلايا النووية الأحادية الدم الطرفية الأولية (PBMCs) مع جينات ترميز CAR خاصة بالفيروسات وبصيلات الخلايا B توجيه جزيء chemokine مستقبلات الكيماوي5 (CXCR5). يستغرق هذا الإجراء تسعة أيام ويؤدي إلى مجموعات خلايا T المستحثة التي تحافظ على النمط الظاهري للذاكرة المركزية. وقد ثبت الحفاظ على ذاكرة مركزية أو أقل تميز ًا في النمط الظاهري للاقتران باستمرار الخلايا بعد التسريب. وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا المنتجة بهذه الطريقة مستويات عالية من الجدوى، ومستويات عالية من التعبير المشترك للجينين المستحثين، وكميات كبيرة بما يكفي من الخلايا للضخ المناعي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمدة تسعة أيام على نطاق واسع لخلية CAR-T وغيرها من أساليب العلاج المناعي للخلايا T. وتستند الأساليب الموصوفة هنا إلى الدراسات المقدمة في منشوراتنا السابقة.

Introduction

تظهر العلاجات المناعية الخلوية كوسيلة جديدة لعلاج الأمراض بما في ذلك السرطانات والأمراض المعدية. غالبًا ما تنطوي طرق العلاج المناعي هذه على التلاعب الجيني بالخلايا العلاجية للتعبير عن جزيئات محددة. على سبيل المثال، تم تصميم مستقبلات مستضد الكيميري (CAR) الخلايا التائية للتعبير عن جزيء CAR الذي يحتوي على مجال خارج الخلية يربط على وجه التحديد الجزيئات على الخلايا المريضة ومجال الإشارات الذي يحفز الخلايا المناعية لقتل الخلية المريضة. يتم استخدام خلايا CAR T بنجاح في العلاجات المناعية للسرطان ، وكانت فعالة بشكل خاص في علاج سرطان الدم ب الخلية1،2،3. كما يجري تطوير خلايا CAR-T لعلاج العدوى الفيروسية مثل فيروس نقص المناعة البشرية. CARs فيروس نقص المناعة البشرية تستهدف البروتينات المغلف على سطح الخلايا المصابة فيروسيا4. كما يمكن تصميم الخلايا المناعية للتعبير عن جزيئات التوجيه لاستهداف الخلايا العلاجية إلى مواقع محددة من الأنسجة. لقد طورنا ناقلات نقل كل من CAR الخاصة بالفيروسات وكذلك جزيء توجيه الجريب اللمفاوي CXCR55.

ويتركز النسخ المتماثل الفيروسي لبعض الفيروسات، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وفيروس نقص المناعة السيميان (SIV)، داخل بصيلات الخلايا B في الأنسجة اللمفاوية الثانوية6. بصيلات الخلايا B هي مواقع محصنة مميزة إلى حد ما تسمح فيها مستويات منخفضة من CTL الخاصة بالفيروسات بتكرار الفيروسيةالمستمرة 7,8. لهذه الأسباب، استهداف فيروس نقص المناعة البشرية / SIV الخلايا التائية الخاصة في المسام من خلال التعبير عن CXCR5 هو استراتيجية للقضاء على خزان الجريب من الخلايا المصابةفيروسي9,10. على وجه التحديد، نحن نستهدف خلايا CAR T الخاصة بـ SIV إلى بصيلات الخلايا B عبر التعبير المشترك CXCR5.

في هذا البروتوكول نصف طريقة لtransduce CAR/CXCR5 وتوسيع PBMCs لإنتاج CAR/CXCR5 T خلايا من كميات كافية للضخ العلاجي. الخلايا المستحثة مع هذه الأساليب الحفاظ على النمط الظاهري الذاكرة المركزية. وقد أظهرت الدراسات أن الخلايا ذات النمط الظاهري أقل تميّزا, مثل الخلايا التائية الذاكرة المركزية والخلايا الجذعية الذاكرة T أفضل من الخلايا أكثر تمايز111,,12. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتوكولات المصممة لإنتاج الخلايا المنقولة بالتبني لها أوقات ثقافة طويلة نسبياً تؤدي إلى خلايا لديها نمط ظاهري أكثر تمايزًا وتقليل الثبات13. وعلاوة على ذلك، الخلايا المنقولة بالتبني مع أوقات الثقافة الطويلة المتراكمة داخل الرئتين بدلا من الأنسجة اللمفاوية المستهدفة في المكاك ريسوس14,15. في الطرق التي نصفها ونشرح هنا، ونحن بسرعة transduce وتوسيع rhesus المكاك PBMCs لإنتاج الخلايا التائية المستحثة التي تحافظ على النمط الظاهري الذاكرة المركزية.

يتم تضمين كل من خلايا CD4 و CD8 T في نهج العلاج المناعي لدينا. تم اختيار هذه الخلايا المختلطة لأنه، في التجارب السريرية، كان هناك ارتباط غياب خلايا CD4+ T في منتج الخلايا T CD8+ مع فشل خلايا CD8 T المشبعة لتستمر 16. الطرق الموصوفة هنا تبدأ بتفعيل PBMCs مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3 والمضادة CD28 التي تحفز بقوة مستقبلات الخلايا T وتوفر إشارة تحفيزية للمشترك لتجنب الأنجي ة البرسيم17,18.

بعد التنشيط، يتم نقل الخلايا مع ناقل جاماريتروفيروسات ترميز سيارة خاصة بفيروس وجزيء توجيه اللمفاويCXCR5. ثم يتم توسيع الخلايا المستحثة باستخدام لوحات مصممة لنشر الخلايا غير الملتصقة التي تحتوي على غشاء نفاذي للغاز في القاعدة. يسمح هذا الغشاء تبادل الغاز في الجزء السفلي من البئر مما يؤدي إلى تعزيز بقاء الخلايا وتوافر المغذيات19. باستخدام هذه الأساليب، يمكن إنتاج خلايا وظيفية كافية في إطار زمني لمدة 9 أيام لدراسات التسريب في الجسم الحي. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لنقل وتوسيع خلايا rhesus المكاك T، مع تعديل طفيف من الأجسام المضادة تفعيل الأنواع محددة، ويمكن استخدامه مع خلايا من الأنواع الأخرى. وتستند هذه الأساليب على دراساتنا المنشورة سابقا9،20.

Protocol

ملاحظة: يتطلب بروتوكول نقل PBMC rhesus PBMC استخدام ناقل جاماريتروفيس. لاحظ أن فيروس غاماريتريا يمكن إنتاجه إما في المختبر أو الاستعانة بمصادر خارجية لشركة إنتاج فيروسي. في الإنتاج المختبري يمكن تنفيذها مع البروتوكول المبين في الخطوة 1 ويمكن titered الفيروس على النحو المبين في الخطوة 2. وسواء أُنتج الفيروس في الموقع أو من قبل شركة إنتاج، ينبغي تحديد وزارة الداخلية (نسبة الفيرفونات المعدية إلى الخلايا في الثقافة)، على النحو المبين في الخطوة 3، لكل إعداد فيروسي حديث الإنتاج وخلايا الاهتمام. تنبيه: يتطلب العمل مع ناقلات فيروس غاماريتروفيروسات أو ناقلات أخرى للفيروسات الرجعية احتياطات السلامة المناسبة مثل استخدام معاطف المختبر وطبقات مزدوجة من القفازات. يجب أن يحدث كل التعامل مع الفيروس في غطاء السلامة البيولوجية. يجب إزالة التلوث من جميع الأنابيب في محلول من التبييض 10٪ لمدة 30 دقيقة. يجب إزالة التلوث من جميع النفايات المعدية السائلة بتركيز نهائي قدره 10٪ من التبييض. الاحتواء الثانوي، مع ختم يمنع إطلاق الهباء الجوي الميكروبيولوجي، مطلوب للمركزية 1- إنتاج مخزون جاماريتروفيروسات لوحة 293T خلايا للتَلَث. يتطلب إعداد الفيروس الكامل 12 قارورة T75 في 4.5 × 106 خلايا / قارورة في وسيط النسر المعدلة في دولبيككو (DMEM) + 10٪ مصل البقر الجنين (FBS) دون المضادات الحيوية. السماح للخلايا تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية قبل التعشية. تمييع 60 ميكرولتر من كاشف الترانزستور في 1.5 مل انخفاض وسائل الإعلام المصل. إعداد أنبوب واحد لكل قارورة. احتضان لمدة 5 دقائق في RT. لكل قارورة، قم بإعداد أنبوب يحتوي على 1.5 مل من وسائط المصل المخفضة والبلازميدات التالية: 9.0 ميكروغرام من البلازميد نقل يحتوي على الجينات (الجينات) ذات الأهمية، 3 ميكروغرام من RD114 و 1.2 ميكروغرام من VSV-G (البلازميدات المغلف)، و 3 ميكروغرام من الهفوة / البول.ملاحظة: هناك حاجة إلى المغلف والجينات هفوة / بول للتغليف الرجعية. لإنتاجنا للفيروسات الرجعية، نضيف كل من مغلف RD114 و، لمزيد من الاستقرار، كمية صغيرة من مغلف VSV-G. إضافة البلازميدات المخففة (الخطوة 1.4) إلى كاشف التَرَق المخفف (الخطوة 1.3). مزيج بلطف. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغذية الخلايا 5 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة وإضافة 3 مل من الكاشف التقافي / خليط البلازميد dropwise لكل قارورة واحتضان لمدة 5-6 ساعة في 37 درجة مئوية. أضف 5 مل إضافية من المتوسط الطازج إلى القوارير واحتضانها لمدة 42-43 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد وقت التبضع الكلي من 48 ساعة، وجمع وسائل الإعلام وأجهزة الطرد المركزي في 1282 × ز لمدة 3 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة حطام الخلايا. Aliquot إلى وحدات التخزين المناسبة للاستخدام في المستقبل ، فلاش تجميد الفيروس في حمام الجليد الإيثانول / الجافة وتخزينها في -80 درجة مئوية. 2. Titering فيروس غاماريترو ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى العديد من تخفيف اتّهاب الفيروس للحصول على جهاز تتر صالح. لوحة 293T الخلايا في 600،000 الخلايا / جيدا في لوحة 6 بئر واحتضان لوحات لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية. إزالة المتوسطة من الخلايا وإضافة المبلغ المطلوب من DMEM + 10٪ FBS إلى 293T (2 مل الحجم الإجمالي للفيروس). إضافة الفيروس إلى البئر المقابلة ودوامة بلطف لخلط. على سبيل المثال، أضف 200 ميكرولتر و100 ميكرولتر و50 ميكرولتر و25 ميكرولتر على التوالي إلى 4 آبار. وتشمل بئر اليس فيروس استعمل تدفق قياس الخلايا (عينة وهمية). احتضان لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية. Trypsinize الخلايا 293T عن طريق إضافة 0.5 مل من التربسين-EDTA واحتضان لمدة 4 دقيقة في 37 درجة مئوية. وقف التربسين عن طريق إضافة 1.5 مل من DMEM + 10٪ FBS. عد الخلايا وتحديد قابلية البقاء مع عداد الخلية الآلي أو مقياس الهيموكيتومتر. لاستخدام عداد الخلية، أضف 10 ميكرولتر من الخلايا إلى 10 ميكرولتر من اللون الأزرق الترباني، اخلط، وقم بتحميل شريحة الغرفة، وأدخل في العداد. اضغط على زر “التقاط” لحساب الخلايا. جمع 0.5-1 × 106 خلايا وتقييم مستويات CAR و CXCR5 عن طريق قياس الخلايا التدفق (انظر الخطوة 9.5). التعبير عن CD4 أو MBL جنبا إلى جنب مع CXCR5 ستحدد الخلايا المستحثة 293T المشتركة في التعبير عن جمهورية أفريقيا الوسطى وCXCR5. انظر الأجسام المضادة التفاعلية في الخطوة 9.5.1. حساب titer الفيروسية.ملاحظة: اختر العينة بمستوى نقل 20% أو أقل لحساب التتر. استخدم الصيغة التالية لحساب titer:وحدات نقل/ مل = (عدد الخلايا في الثقافة)(% من الخلايا المستحثة)/حجم الفيروس المضاف إلى الثقافة 3. تحديد وزارة الداخلية الأمثل لإعداد الفيروسية المنتجة حديثا وخلايا الاهتمام اتبع بروتوكول النقل (الأقسام 4-9) مع PBMCs الأولية والتخفيف المزدوج من إعداد جاماريتروفيروسات. تقييم مستوى التعبير عن الجينات ذات الاهتمام عن طريق قياس الخلايا التدفق (الخطوة 9.5). اختيار تركيز الفيروس الذي يسمح نقل أقصى دون فقدان قدرة الخلية على البقاء. 4. إعداد لوحات لتنشيط خلية تي عن طريق طلاء ويلز مع الأجسام المضادة المضادة CD3 إعداد الأجسام المضادة CD3 المضادة للماكاك (FN18) عن طريق تخفيف المخزون إلى 10 ميكروغرام / مل في المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS). الاستغناء 2 مل / جيدا في لوحات 6 بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، بدلا من ذلك، يمكن احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 4 °C. يستنشق برنامج تلفزيوني والأجسام المضادة غير المنضمة. شطف الآبار مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني واستخدامها على الفور لوحة PBMCs. 5. تحفيز Rhesus PBMCs مع لوحة ملزمة مكافحة CD3 وقابلة للذوبان المضادة CD28 ذوبان الجليد rhesus PBMCs الأولية في حمام مائي 37 درجة مئوية، مع الانفعالات لطيف، حتى مجرد كمية صغيرة من الجليد لا يزال. في غطاء محرك السيارة، خلايا ماصة بلطف في أنبوب مخروطي. شطف القارورة مع 1 مل من المتوسط الأساسية وإضافتهببطء إلى الخلايا. بعد ذلك، أضف ببطء 9 مل إضافية من الوسط الأساسي الدافئ إلى الخلايا.ملاحظة: يمكن توسيع نطاق هذه الخطوة ولكن لا تذوب أبداً أكثر من 4 قوارير في وقت واحد. الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 5 دقيقة في 22 درجة مئوية لبيليه الخلايا. يستنشق supernatant ثم إعادة تعليق بيليه في كمية صغيرة من متوسط النمو. اختيار حجم بحيث تركيز الخلايا سوف تتجاوز 2 × 106 خلايا / مل في هذه المرحلة منذ التركيز النهائي يجب أن يكون 2 × 106 خلايا / مل. خلايا وصمة عار مع الأزرق trypan والعد الخلايا لتحديد عدد من الخلايا القابلة للحياة.ملاحظة: يمكن القيام بذلك باستخدام مقياس hemocytometer القياسية أو عداد الخلية الآلي. نحن نستخدم عداد الخلية الآلي الذي يعرض قابلية وعدد من الخلايا الحية. لاستخدام العداد، أضف 10 ميكرولتر من الخلايا إلى 10 ميكرولتر أزرق، اخلط، وقم بتحميل شريحة الغرفة وأدخلها في العداد. اضغط على زر “التقاط” لحساب الخلايا. حساب العدد الإجمالي للخلايا عن طريق ضرب تركيز الخلايا من حيث الحجم ثم تمييع الخلايا إلى 2 × 106 خلايا / مل في وسط النمو. قبل الطلاء، أضف مضاد CD28 إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام/مل من أجل توفير إشارة تحفيزية مشاركة ضرورية لتنشيط الخلية T. خلايا الماصة في لوحات مغلفة مضادة لCD3. إضافة 3-6 × 106 خلايا لكل بئر (هدف جيد هو 4 × 106 خلايا في 2 مل وسائل الإعلام لكل بئر) واحتضان لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في CO25٪. 6. إعداد لوحات مغلفة بليفيكتين ملاحظة: PBMC والخلايا تي التعبير عن مستقبلات integrin VLA-4 أو VLA-5 وأهداف جيدة لنقل الليفية بوساطة. قبل طلاء لوحات، أولا إعداد كاشف الليفية عن طريق تخفيف 1:100 في PBS العقيمة. Pipette 2 مل من محلول فيليكينتين العقيم في كل بئر من لوحة 6 بئر. لوحات صخرية بلطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: يجب استخدام لوحات أو أطباق أو أطباق أو أطباق غير المعالجة من حيث ثقافة الخلايا في هذه الخطوة. إزالة حل ليفيكتين عن طريق الطموح ومن ثم كتلة مع 1 مل من المعقم 2٪ الزل مصل البقري (BSA، كسر الخامس) في برنامج تلفزيوني. صخرة لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. يستنشق محلول BSA ويغسل الطبق بـ 2 مل من PBS. بعد التطلع إلى برنامج تلفزيوني، يمكن ختم الصفائح المغلفة بالليفيتين بغلاف الختم وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.ملاحظة: نحن عادة إعداد لوحات يوم واحد قبل نقل. 7. نقل من تنشيط rhesus PBMCs تنبيه: يتطلب العمل مع ناقلات الفيروسات أو مع أجهزة PBMCs المكاك rhesus استخدام احتياطات السلامة المناسبة مثل استخدام معاطف المختبر وطبقات مزدوجة من القفازات. يجب أن يحدث جميع التعامل مع الفيروس والخلايا في غطاء السلامة البيولوجية. يجب إزالة التلوث من جميع الأنابيب في محلول من التبييض 10٪ لمدة 30 دقيقة. يجب إزالة التلوث من جميع النفايات المعدية السائلة بتركيز نهائي قدره 10٪ من التبييض. الاحتواء الثانوي مع ختم يمنع إطلاق الهباء الجوي الميكروبيولوجي ، مطلوب للمركزية. إرفاق ناقل نقل جاماريتروفيروسات إلى فيليفيكتين المغلفة جيدا. قم بتدفئة جهاز الطرد المركزي إلى 32 درجة مئوية عن طريق التشغيل عند 2000 × ز لمدة 30 دقيقة. دافئة على حد سواء المصل مجانا ونمو وسائل الإعلام في حمام مائي 37 درجة مئوية. إذابة الفيروس على الجليد أو عن طريق دوامة بلطف القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تبقى كمية صغيرة فقط من الجليد. لتجنب تدهور إعداد الفيروسية، لا تسمح للمحتويات للاحماء. تمييع الفيروس الرجعي إلى تعدد مثالي محدد مسبقًا للعدوى (MOI) في وسط خال ٍ من المصل.ملاحظة: مع فيروس غاماريترووفيروسات لدينا وrhesus PBMC، لقد وجدنا أن وزارة الداخلية من 0.5 هو الأمثل. مثال تخفيف: لمعطف 4 آبار مع الفيروس وإضافة 1.5 × 106 خلايا، (4) (1.5 × 106)(0.5) = 3 × 106 TU هناك حاجة. إذا كان التتر الفيروسي هو 1.1 TU/mL ، ثم استخدام فيروس 2.7 مل في وسائل الإعلام 5.3 مل لحجم إجمالي قدره 8 مل. إضافة 2 مل الفيروس الرجعي المخفف إلى كل بئر من لوحة المغلفة فيليفيكتين. للتحكم السلبي الخلايا المنقّحة وهمية، إضافة وسائل الإعلام وحدها إلى الآبار المغلفة فيليكرياتين. ضع الألواح في جهاز الطرد المركزي 32 درجة مئوية الذي تم تسخينه مسبقًا في حاملات الألواح الدقيقة مع أغطية آمنة بيولوجيًا وطارد ة مركزية بسعر 2000 × ز لمدة ساعتين.ملاحظة: يمكن استخدام لوحات مغلفة بالفيروسات على الفور أو تخزينها، مع الفيروس، في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. للاستخدام الفوري، تستنشق إعداد الفيروس من الآبار وإضافة 2 مل من متوسط النمو. الحفاظ على الآبار المغلفة بالفيروس من التجفيف. لوحة PBMCs حفز. تحقق من الخلايا باستخدام المجهر المقلوب. يجب أن تبدو الخلايا صحية ، مما يعني أنها خفيفة مستديرة ومشرقة وانكسارية. وينبغي أيضا أن تظهر مظهر تكتل تشير إلى التحفيز. جمع الخلايا المستهدفة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل. شطف جيدا مرة واحدة مع 1 مل وسائط النمو وإضافة إلى أنبوب مخروطي. عد عدد الخلايا الحية مع عداد الخلية الآلي كما هو الحال في الخطوة 5.4.ملاحظة: سيتم تكتل الخلايا المحفزة وقد يؤدي هذا التكتل إلى صعوبات في عد الخلايا بدقة. بيليه الخلايا في الأنابيب عن طريق الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 5 دقيقة في 32 درجة مئوية. ينسخ وسائل الإعلام من بيليه الخلية وإعادة تعليق الخلايا في وسط النمو بتركيز 1.5 × 106 خلايا / مل. إلى كل فيروس المغلفة جيدا (أعدت في الخطوة 7.1) إضافة 1 مل من تعليق الخلية لما مجموعه 1.5 × 106 خلايا / 3 مل. لاحظ أن كل بئر يحتوي بالفعل على 2 مل متوسط النمو. أداء نفس الخطوات للخلايا المُنقلة وهمية ولكن لوحة لهم على الآبار المغلفة فيليكرياتين التي لم تتلق أي فيروس. طرد مركزي لوحات في 1000 × ز لمدة 10 دقيقة في 32 درجة مئوية. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2. 8. توسيع الخلايا المنقولة رسم محتويات الآبار صعودا وهبوطا مع أنبوب 5 مل من أجل إعادة تعليق الخلايا ومن ثم نقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام النمو إلى كل بئر ورسم صعودا وهبوطا مع أنبوب نقل معقمة لإزالة الخلايا الملتصقة. عد الخلايا لتحديد إجمالي عدد الخلايا وقابليتها للتطبيق باستخدام عداد الخلية التلقائي كما هو الحال في الخطوة 5.4. إذا رغبت في ذلك، قم بإزالة 1 × 106 خلايا للتدفق الخلوي لتقييم التعبير الجيني والنمط الظاهري. انظر الخطوة 9.5.1 وجدول المواد للأجسام المضادة الموصى بها واستراتيجية الجاتينغ. طرد الخلايا في 600 × غرام لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية. ينسخ وسائل الإعلام وإعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام التوسع إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل. البذور كل بئر الغاز نفاذية من لوحة 6 بئر مع 5 مل من الخلايا. بعناية طبقة إضافية 25 مل من توسيع وسائل الإعلام في البئر.ملاحظة: نضيف الخلايا في وحدة تخزين صغيرة ثم طبقة الوسائط المتبقية بحيث تبقى الخلايا على الجزء السفلي من البئر. احتضان الخلايا دون عائق في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ لمدة 4 أيام. 9. جمع الخلايا الموسعة وتقييم النمط الظاهري لأعداد الخلايا المستحثة جمع الخلايا من الآبار نفاذية الغاز عن طريق إزالة والتخلص من وسائل الإعلام 20 مل. وينبغي توخي الحذر لتجنب إزعاج الخلايا.ملاحظة: نقوم بتوسيع الخلايا لمدة 4 أيام فقط وجمع الخلايا في هذه المرحلة. ومع ذلك، إذا كانت هناك أيام إضافية من الثقافة المرغوبة، قم بإزالة 20 مل من الوسائط دون إزعاج الخلايا واستبدالها بـ 20 مل من وسائط التوسع الجديدة. Pipet وسائل الإعلام المتبقية صعودا وهبوطا لطرد الخلايا. يجب أن تكون وسائل الإعلام غائمة للغاية إذا نمت الخلايا بشكل جيد. باستخدام أنبوب نقل معقم، شطف كل جيدا مع وسائط 3 مل لجمع أي خلايا المتبقية. عد الخلايا مع العداد الآلي أو مقياس الهيموكيتومتر للتحقق من الجدوى ورقم الخلية. إجراء قياس خلايا التدفق لتحديد التعبير الجيني المستحث والنمط الظاهري للخلية. في هذا المثال، حدد rhesus المكاك PBMC فييوموبلات باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد CD4 (M-T477)، وهو استنساخ تفاعلي مع كل من rhCD4 الذاتية وجمهورية أفريقيا الوسطى rhCD4-MBL; ضد CD3 (SP34-2) و CD8 (RPA-T8) التي تصبغ مجموع الخلايا T وخلايا CD8 T على التوالي؛ ضد مستقبلات الموت CD95 (DX2) وجزيء محفز ة CO28 (CD28.2) التي تستخدم لتحديد النمط الظاهري للذاكرة من الخلايا؛ وضد CXCR5 (MU5UBEE) وMBL (3E7) للكشف عن CXCR5 و CD4-MBL CAR على الخلايا المستحثة. تم تقييم الجدوى مع صبغة قابلية للتثبيت. إعداد الخلايا للتدفق قياس الخلايا. يشكلون مزيج الأجسام المضادة الرئيسية للعدد الإجمالي للأنابيب. رفع ما يصل إلى إجمالي حجم باستخدام برنامج تلفزيوني. إضافة الخلايا لتدفق الأنابيب. ضع 0.5-1 × 106 خلايا لكل أنبوب. وتشمل الضوابط السلبية مثل الخلايا غير الملطخة وكذلك الخلايا الملطخة وهمية المستحثة. أضف 2 مل من PBS إلى الخلايا، والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) وdecant. إضافة 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة إلى الأنابيب واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في RT وdecant. أضف 300 ميكرولتر من 1% بارامايدهايد وحضن لمدة 15 دقيقة. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في RT وdecant. إضافة 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ومزيج. على مقياس التدفق الخلوي، احصل على 150,000 حدث لكل عينة. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل التدفق.ملاحظة: تم نشر استراتيجية الجاتينغ مسبقاً20. لتحديد الخلايا المستحثة، وخلايا البوابة على الخلايا الليمفاوية، والعزاب، ويعيش، CD3 +، وMBL + CXCR5 +. لتحديد عدد الذاكرة المركزية، وخلايا البوابة على الخلايا الليمفاوية، الفردي، CD3 الحية +، CD8+، CD28 + CD95+. استخدام الخلايا حسب الحاجة. يمكن استخدام الخلايا في المقالات المختبرية للوظيفة ، مثل فحص ترحيل المتحولين9 أو في الخلايا المختبرية القتل المنقاة5،9. يمكن استخدام الخلايا للضخ في الحيوانات. بدلا ً من ذلك، قم بتجميد أي خلايا متبقية في FBS بنسبة 90% مع 10% من ثنائي ميثيل السلفوك (DMSO) لاستخدامها أو تحليلها في وقت لاحقملاحظة: في حين لم يتم بعد تحديد جرعة مستهدفة لضخ الخلايا المنقولة بالتبني في مكاك ريسوس، استخدمت دراسات النقل بالتبني المنشورة في الرئيسيات غير البشرية 0.6 إلى 1.2 × 107 خلايا/كجم21،و1 إلى 5 × 108 خلايا/كجم22 و 1.4 إلى 8 × 108 خلايا/كجم10. مع هذا النطاق كمبادئ توجيهية، يمكن إنتاج خلايا كافية للضخ مع هذا البروتوكول لمدة 9 أيام.

Representative Results

إنتاج الخلاياالنتائج المعروضة في هذا المنشور مماثلة لتلك الموجودة في عملنا المنشور سابقا9،20. باستخدام البروتوكول المعروض هنا، نتوقع على الأقل توسعًا 8 أضعاف للخلايا بين اليومين 5 و9 (متوسط 11.1 أضعاف، نطاق 8.7-13 أضعاف). تم بذر الآبار القابلة للنفاذ بالغاز بكثافة بدء 5 × 106 خلايا وبعد 4 أيام من النمو ، حققنا كثافة متوسطة قدرها 55.6 × 106 خلايا لكل بئر (النطاق 43.5-64.8 × 106)(الشكل 1A). يظهر عد الخلايا مع استبعاد تريبان بلو أن الخلايا تحافظ على صلاحية عالية طوال البروتوكول (اليوم 9 متوسط 85.8٪، نطاق 83-95٪). (الشكل1ب). نجد تقلب الحيوان إلى الحيوان في قدرة الخلايا على التوسع. ومع ذلك، مع عدد السكان بدءا من 50-100 × 106 خلايا في اليوم 1، وقد استخدمنا هذا البروتوكول لإنتاج خلايا كافية لضخ المكاك ريسوس من 1-2 × 108 خلايا / كجم. تم رصد التعبير المشترك للجينات المستحثة مع قياس الخلايا التدفق(الشكل 2A). وكان التعبير عن جمهورية أفريقيا الوسطى وCXCR5 على سطح الخلايا المستحثة مستقرا نسبيا بين اليومين 5 و 9 من بروتوكول التوسع هذا. في اليوم الخامس، يبلغ متوسط 42.8% (يتراوح بين 36.5 و46.9%) من الخلايا تم نقلها مع كل من CD4-MBL CAR و CXCR5 بينما في اليوم 9، كان متوسط التعبير 47.6٪ (النطاق 44.5-64.5٪ ) مع جولة واحدة من نقل(الشكل 2B). على الرغم من أن بعض البروتوكولات تدعو إلى جولة ثانية من النقل، لم نر فائدة من حيث مجموع الخلايا المنقولة في نهاية البروتوكول (البيانات غير مبينة). النمط الظاهري للخليةتم تحليل الخلايا المستحثة عن طريق قياس التدفق الخلوي لمراقبة النمط الظاهري للذاكرة. قبل نقل وتوسيع، يتم تحديد السذاجة، والذاكرة المركزية وتجمعات الذاكرة effector (البيانات غير مبين) ولكن يتم فقدان السكان السذج مع زراعة والخلايا هي في المقام الأول خلايا الذاكرة المركزية بحلول اليوم 5(الشكل 3A)واليوم 9(الشكل 3B)كما تم تحديدها من قبل CD95+ CD28+ التعبير. وقد أنتج استخدام هذا البروتوكول السريع للنقل والتوسع خلايا هي في المقام الأول خلايا الذاكرة المركزية، وبالتالي سيكون من المرجح أن تتكاثر وتستمر عندما غرست في الحيوان اختبار. الشكل 1: ينتج بروتوكول النقل والتوسع خلايا مُستورَعة وفيرة قابلة للتطبيق بدرجة كبيرة. (أ)توسع الخلايا المستحثة من 6 أنواع مختلفة من الأيام 5 إلى 9 في السفن القابلة للنفاذ ية للغاز و(B)صلاحية PBMC المستحثة من نفس 6 الحيوانات. تم استخدام استبعاد Trypan الأزرق باستخدام عداد الخلية الآلي لمراقبة رقم الخلية وقابليتها للاستمرار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: ينتج بروتوكول النقل خلايا تحافظ على التعبير المشترك عن الجينات المنقولة. (أ)مؤامرة تدفق تمثيلية من rhesus PBMC في اليوم 9 من بروتوكول النقل والتوسع مما يدل على التعبير عن كل من CD4-MBL CAR و CXCR5. (ب)التعبير عن CD4-MBL CAR و CXCR5 على rhesus PBMC المستحثة من 6 الحيوانات المختلفة في الأيام 5 و 9 في الثقافة كما تقاس بتدفق قياس الخلايا. تم تعيين غيتس على الهواء مباشرة، CD3+ الخلايا. يتم تعريف الخلايا المستحثة على أنها MBL+ CXCR5+. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: غالبية الخلايا المنتجة في بروتوكول 9 أيام لها نمط فينوموياً مركزي الذاكرة. مؤامرة التدفق التمثيلي للقياس الخلوي من (A) اليوم 5 و(B)اليوم 9 CAR / CXCR5 – المنقولة ريسوس PBMC. تم تعيين غيتس على الهواء مباشرة، CD3+، CD8+ الخلايا. تم تعريف الذاكرة المركزية على أنها CD28+ CD95+. تم تعريف ذاكرة Effector على أنها CD28-CD95+. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هذا البروتوكول يحدد استراتيجية إنتاج العلاج المناعي الخلايا تي الذي يستخدم ناقل جاماريتروفيروسات إلى transduce rhesus المكاك PBMC مما يؤدي إلى مجموعة الخلايا T التي تعبر عن CAR المضادة للفيروسات وكذلك مستقبلات توجيه الجريبية، CXCR5. مع ما مجموعه 8 أيام من وقت ثقافة الجسم الحي السابق ، يتم إنتاج خلايا T CAR القابلة للحياة والوظيفية في كمية تقع ضمن النطاق المنشور10،21،22 المستخدمة للضخ في الرئيسيات غير البشرية لاختبار الفعالية قبل السريرية.

ويعتمد نجاح بروتوكول النقل على كل من مركبات PBMCs الصحية والمحفزة وعلى المستحضرات الجيدة لفيروس غاماريترو. من أجل تحقيق التحفيز الناجح والنقل ، من الضروري أن يتم توخي الحذر المناسب في تجميد ونقل PBMCs بعد جمعها. من الناحية المثالية ، إذا تم جمع الخلايا خارج الموقع ، يتم شحنها في النيتروجين السائل ووضعها بسرعة في تخزين النيتروجين السائل على المدى الطويل. يجب أن تكون مركبات PBMCs نشطة mitotically من أجل أن يتم نقلها بنجاح بواسطة فيروس غاماريترية. يجب على المرء رصد بصريا لتجميع الخلايا بعد التحفيز مع مكافحة CD3/anti-CD28. الفشل في تنشيط بشكل صحيح سوف يسبب انخفاض كفاءة نقل. من المهم أيضًا مراقبة قابلية البقاء في الخلايا المحفزة. ضعف الجدوى بعد خطوة التحفيز عادة ما يؤدي إلى نقل أقل نجاحا. سواء تم إنتاج مستحضرات الفيروس في المختبر أو الاستعانة بمصادر خارجية ، يجب تخزينها عند -80 درجة مئوية في aliquots استخدام واحد لتجنب تجميد دورات ذوبان الجليد التي يمكن أن تلحق الضرر بالفيروس وإضعاف كفاءة النقل. يجب أن يكون الفيروس titered بحيث يمكن استخدام كميات متسقة من الفيروس في كل تجربة. عند استخدام الفيروس لنقل، إذابة الفيروس بسرعة وتخزينها على الجليد حتى الحاجة. اختيار البروتينات المروج، محسن ومغلف قد تؤثر جميع كفاءة نقل وتعبير عن transgene في الخلايا المستهدفة. وبالتالي، يجب تحديد وزارة الداخلية تجريبياً. وبالإضافة إلى ذلك، أدى استخدام وسائط مصممة لدعم الخلايا التائية والصحون ذات الآبار القابلة للنفاذ بالغاز للتوسع إلى توسع ممتاز في الخلايا المنقولة. ومع ذلك ، هناك تقلب بين الحيوان والحيوان في معدل توسع الخلية. نوصي بإجراء دراسة تجريبية لتحديد قدرة إعداد خلية معينة على أن يتم نقلها وتوسيعها. ومستويات التوسع متسقة في كل من عمليات النقل الصغيرة والكبيرة النطاق.

مع استخدام هذا البروتوكول، أنتجنا ما يصل إلى 2.5 × 109 خلايا للضخ في اختبار الحيوانات. على الرغم من أننا وجدنا أنه من غير الضروري توسيع نطاق البروتوكول في هذا الوقت ، فإن استخدام 6 لوحات بئر هو قيد على إعداد الخلايا على نطاق واسع وسيتطلب البروتوكول تعديلًا لإنتاج أعداد أكبر من الخلايا. ومن الأمثلة على التعديلات المحتملة تنفيذ النقل في كيس ثقافة مغلف بالليفية لزيادة عدد الخلايا المنقولة واستخدام وعاء أكبر لثقافة الغاز القابلة للنفاذ ية لخطوة التوسع. وعلى الرغم من أننا لم نُحَب َ بعد هذه التعديلات، فإنها تستخدم منتجات متاحة تجارياً، وهي تعديلات قابلة للتنفيذ على البروتوكول الحالي.

وباستخدام هذه الطريقة، قمنا بإنتاج خلايا مرسلة من PBMC معزولة عن الحيوانات غير المصابة، والحيوانات المصابة بسيف ومن الحيوانات المصابة بسيف التي تعالج بالعلاج المضاد للفيروسات القهقرية. ومع ذلك ، لاحظنا انخفاضًا في كفاءة النقل في الخلايا المعالجة بمضادات الفيروسات القهقرية20. ومن المفترض أن هذا الانخفاض يرجع إلى تثبيط النسخ العكسي و / أو integrase من المخدرات. وستتطلب عمليات نقل الخلايا من الحيوانات المعالجة بمضادات الفيروسات القهقرية إدخال تعديلات على هذا البروتوكول مثل خفض المستويات داخل الخلايا من عقاقير العلاج المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق وقف العلاج المضاد للفيروسات القهقرية لعدة أيام قبل جمع PBMC أو من خلال استخدام ناقل بديل لا يتأثر بأدوية ART المستخدمة عادة.

من المهم أن تكون الخلايا المنتجة للعلاج المناعي ذات النمط الظاهري المتمايز الحد الأدنى بحيث تستمر بعد التسريب12. على الرغم من أن العديد من البروتوكولات لنقل الخلايا بالتبني تتطلب أوقات ثقافة طويلة، فقد تم ربط انخفاض وقت ثقافة الجسم الحي مع كل من انخفاض في التمايز وتحسين في وظيفة خلية T CAR13. الإطار الزمني السريع نسبيا لهذا بروتوكول النقل والتوسع يسمح بالحفاظ على النمط الظاهري للذاكرة المركزية المطلوبة في حين لا يزال إنتاج خلايا كافية لاختبار إمكاناتها المناعية20.

الهدف من استراتيجية الإنتاج لهذا المنتج العلاج المناعي الخلايا تي هو تصنيع الخلايا التائية التي سوف تعترف الخلايا المصابة SIV، وسوف المرور إلى موقع النسخ المتماثل الفيروسي في بصيلات B وسوف تستمر في الحيوان مما أدى إلى على المدى الطويل علاج وظيفي دون الحاجة إلى الأدوية المضادة للفيروسات الرجعية. للترجمة إلى منتج العلاج المناعي البشري ، يمكن تعديل هذا البروتوكول إلى خلايا T ية بشرية من خلال استخدام الأجسام المضادة والسيتوكينات الخاصة بالإنسان وتنفيذ معايير GMP بهدف نهائي هو إنتاج علاج وظيفي لـ فيروس نقص المناعه البشريه.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل المنح المعاهد القومية للصحة 5R01AI096966-06S1 (PS، EC، وEB)، 1UM1AI26617 (PS، EC و EB)، P51OD0111106/P51RR0000167 (ER)، MN REACH منحة 5U01HL127479-03 (PS)، 1R01A143380-01 (PS و EB)، 1UM14126617 (PS وEC) وكذلك الأموال المقدمة من شعبة NIAID للبحوث داخل الجداريات وبرنامج مكافحة الفيروسات المضادة للفيروسات المضادة للفيروسات الهوائية تم توفير مضاد CD3 ومكافحة CD28 المستخدمة في هذه الدراسات من قبل الموارد الكاشفة الرئيسيات غير البشرية المعاهد القومية للصحة (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 المستخدمة في هذه الدراسات تم توفيرها من قبل مستودع ما قبل السريرية NCI. نشكر المتعاونين معنا في هذا المشروع CD4-MBL CAR/CXCR5، والدكتورة إليزابيث كونيك في جامعة أريزونا، والدكتور إدوارد أ بيرغر في NIAID، المعاهد القومية للصحة، والدكتورة إيفا جي راكاز في مركز ويسكونسن الوطني لأبحاث الرئيسيات والدكتور جيف هارت والسيدة بريتي هاران في جامعة مينيسوتا، والدكتورة ليزلي كين في كلية الطب بجامعة هارفارد والدكتورة كاثرين بولارد في معهد أبحاث الأطفال. كما نشكر الدكتور سكوت ماكيفور في جامعة مينيسوتا، والدكتور كريستوفر بيترسون في مركز فريد هاتشينسون للسرطان، والدكتور ماثيو تريفيت في المعاهد القومية للصحة، والدكتورة أغني تاراسيفيكوت في مستشفى سياتل للأطفال، والدكتور كونراد راسل كروز في معهد أبحاث الأطفال على مساعدتهم المفيدة للغاية في تحسين هذا البروتوكول. كما نعرب عن امتناننا للسيدة تشي فان والسيدة جهوماري أليغريا – بيروكال في جامعة مينيسوتا لإنتاج فيروس غاماريتريا، والسيدة كيم ويسغراو في جامعة ويسكونسن – ماديسون لعزلها محطة بناء السلام في الجمهورية.

Materials

Gammaretrovirus preparation
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA Gibco R-001-100
293T cells ATCC CRL-3216
6 well plates, treated CytoOne CC7682-7506
DMEM Gibco 10569-010
Heat-inactivated FBS Hyclone Sh30088.03
Lipofectamine Invitrogen 11668019 transfection reagent
Opti-Mem Invitrogen 31985070 reduced serum media
pBS-CMV-gagpol Addgene 35614 A gift from Dr. Patrick Salmon
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 custom order from GenScript
RD114 A gift from Dr. Ed Berger
T75 flasks CytoOne CC7682-4875
VSV-G pMD.G A gift from Dr. Scott McIvor
T cell stimulation
6 well plates, untreated CytoOne CC7672-7506
Anti-CD28 NHP Reagent Resource Clone: CD28.2
Anti-macaque CD3 NHP Reagent Resource Clone: FN18
Phosphate buffered saline Gibco 14190-144
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells WNPRC Primary cells
For Fibronectin coating
6 well plates, untreated CytoOne CC7672-7506
BSA (Fraction V) HyClone SH 30574.02
RetroNectin (1 mg/ml) TaKaRa T100A
For T cell Expansion
G-Rex 6 Well Plate Wilson Wolf P/N 80240M Plates with gas permeable wells
Media Components
b mercaptoethanol Gibco 21985-023
Heat-inactivated FBS Hyclone Sh30088.03
IL-2 NCI Preclinical Repository
Penicillin/Streptomycin/Glutamine Gibco 10378-016
X-Vivo-15 medium Lonza 04-418Q
Variations of Media used
Basic medium: X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine
Expansion medium: Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol
Growth medium: Basic medium + 50 IU/ml IL-2 Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use.
Cell counting
Countess cell counting chambers Invitrogen AMQAF1000
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen T10282
Trypan blue, 0.4% solution Invitrogen T10282
Flow Cytometry
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit Invitrogen A20186 for conjugation of MBL antibody
anti-CD28-BV605 BD Biosciences 562976
anti-CD3-AF700 BD Biosciences 557917
anti-CD4-FITC BD Biosciences 556615
anti-CD8-BV788 BD Biosciences 563824
anti-CD95-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 561655
anti-CXCR5-PE eBioscience 12-1985-42
anti-MBL Invitrogen MA1-40145-S6
Flow Analysis software FlowJo, LLC FlowJo v10
Flow Cytometer Beckman CytoFlex
Live/Dead Near IR Invitrogen L10119
Other equipment
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage Beckman SX4750 Safety equipment
Beckman Allegra Centrifuge Beckman Sterilgard e3
Cell culture incubator Thermo Fisher Everlast 247
Class II Laminar flow hood Baker Heracell Vios 160i
Extra-Safe Disposable lab coat Fisher Scientific 359232 Personal protective equipment
Microplate carriers with biocertified covers Beckman SX4750A Safety equipment
Rocking platform Benchmark C10228
Swinging bucket rotor Beckman X13-R
X-Gen Nitrile gloves Genesee Personal protective equipment

References

  1. Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).
  2. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  3. Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. Therapeutic T cell engineering. Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).
  4. Kuhlmann, A., Peterson, C. W. Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure. Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).
  5. Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity. Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).
  6. Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).
  7. Connick, E., Mattila, T., et al. CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue. The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).
  8. Connick, E., Folkvord, J. M., et al. Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL. The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).
  9. Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication. Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).
  10. Ayala, V. I., Deleage, C., et al. CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering. Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).
  11. Redeker, A., Arens, R. Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination. Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).
  12. Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting Through Subsets. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
  13. Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
  14. Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection. The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).
  15. Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).
  16. Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies. Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).
  17. Chambers, C. A., Allison, J. P. Costimulatory regulation of T cell function. Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).
  18. Schwartz, R. H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).
  19. Bajgain, P., Mucharla, R., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).
  20. Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).
  21. Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  22. Berger, C., Sommermeyer, D., et al. Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells. Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).

Play Video

Cite This Article
Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype. J. Vis. Exp. (157), e60400, doi:10.3791/60400 (2020).

View Video