Summary
यहां, हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं-व्युत्पन्न साइटोकिन-प्रेरित सीडी 3+सीडी56+ किलर कोशिकाओं के अलगाव और विस्तार को करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और इन विट्रो निदान प्रवाह साइटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके हेमेटोलॉजिकल और ठोस कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ उनके साइटोटॉक्सिकता प्रभाव को दर्शाते हैं।
Abstract
दत्तक सेलुलर इम्यूनोथेरेपी प्रतिरक्षा प्रणाली के माध्यम से कैंसर की पहचान बहाल करने पर केंद्रित है और प्रभावी ट्यूमर सेल हत्या में सुधार । साइटोकिन-प्रेरित हत्यारा (सीआईके) टी सेल थेरेपी कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिक प्रभाव डालने और कैंसर के उपचार में सर्जरी, विकिरण और कीमोथेरेपी के प्रतिकूल प्रभावों को कम करने के लिए सूचित किया गया है। सीआईसी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी), बोन मैरो और गर्भनाल रक्त से प्राप्त किया जा सकता है। सीआईसी कोशिकाएं सीडी 3+सीडी56+ और प्राकृतिक हत्यारा (एनके) फेनोटाइपिक विशेषताओं के साथ टी कोशिकाओं की एक विषम उपजनसंख्या हैं जिनमें प्रमुख हिस्टोकॉम्पेबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) -अप्रतिबंधित एंटीट्यूमर गतिविधि शामिल हैं। यह अध्ययन हेमेटोलॉजिकल और ठोस कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ पीबीएमसी-व्युत्पन्न सीआईके कोशिकाओं की साइटोलिटिक क्षमता के परिमाणीकरण के लिए एक योग्य, चिकित्सकीय रूप से लागू, प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन करता है। साइटोलिटिक परख में, सीआईके कोशिकाओं को प्रीदागित लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के साथ विभिन्न अनुपातों में सह-इनक्यूबेट किया जाता है। ऊष्मायन अवधि के बाद, मृत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या एक न्यूक्लिक एसिड-बाध्यकारी दाग द्वारा निर्धारित की जाती है। यह विधि अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों पर लागू होती है। सीआईके कोशिकाओं में शक्तिशाली साइटोटॉक्सिसिटी होती है जिसे साइटोमीटर सेटअप और ट्रैकिंग (सीएस एंड टी) -आधारित फ्लो साइटोमेट्री सिस्टम द्वारा अपने प्रीक्लीनिकल मूल्यांकन पर कैंसर के इलाज के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में खोजा जा सकता है।
Introduction
साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स एक विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिका आबादी है जो कैंसर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता करता है। लिम्फोकिन-सक्रिय हत्यारा (एलएआर) कोशिकाओं, ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइट्स (टीआईएलएस), प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, 'टी कोशिकाओं, और साइटोकिन-प्रेरित हत्यारा (सीआईके) कोशिकाओं सहित कई प्रभावक कोशिका आबादी दत्तक टी सेल थेरेपी (अधिनियम) प्रयोजनों1के लिए विकसित की गई है। सीआईके कोशिकाओं में रुचि बढ़ रही है, क्योंकि वे ऑटोलॉगस परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीएमबीसी)2से विस्तारित साइटोकिन-प्रेरित साइटोटॉक्सिक सेल आबादी के मिश्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं।
लिम्फोइड जनक कोशिकाओं, माइलोब्लास्ट और लिम्फोब्लास्ट की अनियंत्रित वृद्धि से तीन मुख्य प्रकार के रक्त कैंसर (यानी ल्यूकेमिया, लिंफोमा और मायलोमा), कैंसर (जैसे, फेफड़ों के कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर) और सारकोमा सहित ठोस ट्यूमर, अन्य कैंसरों के बीचहोताहै । सीआईके कोशिकाएं कोशिकाओं की आबादी का एक मिश्रण है जो प्रमुख हिस्टोकॉम्पिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शित करता है - अप्रतिबंधित एंटीट्यूमर गतिविधि और इस प्रकार हेमेटोलॉजिकल और उन्नत ट्यूमर4,5,6,7के उपचार के लिए वादा करते हैं । सीआईके कोशिकाओं में टी कोशिकाओं (सीडी 3+सीडी56−),एनके-टी कोशिकाओं (सीडी 3+सीडी56+),और एनके कोशिकाओं (सीडी 3-सीडी56+)सहित कोशिकाओं का एक संयोजन शामिल है। आईएफएन-ए-, एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी और आईएल-2 के अलावा एक निश्चित शेड्यूल के उपयोग से सीआईके इंडक्शन प्रोटोकॉल का अनुकूलन, सीआईके कोशिकाओं8के विस्तार में परिणाम है। कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ सीआईके कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिक क्षमता मुख्य रूप से एनके समूह 2 सदस्य डी (सी-प्रकार के लेक्टिन जैसे रिसेप्टर परिवार का सदस्य) ट्यूमर कोशिकाओं पर एनकेजी2डी लिगांड, और छिद्र-मध्यस्थता वाले रास्तों9पर निर्भर करती है। एक प्रीक्लिनिकल अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि आईएल-15-उत्तेजित सीआईके कोशिकाओं ने विट्रो में प्राथमिक और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया सेल लाइनों के खिलाफ शक्तिशाली साइटोटॉक्सिकिटी को प्रेरित किया और सामान्य पीबीएमसी और फाइब्रोब्लास्ट9के खिलाफ एक कम एलोरएक्टिविटी का प्रदर्शन किया। हाल ही में, एक चरण द्वितीय नैदानिक अध्ययन में माइलॉयड नियोप्लाज्म उपचार के लिए nonmyeloablative एलोजेनिक प्रत्यारोपण के बाद समेकन के रूप में एक बार स्वस्थ दाता-व्युत्पन्न सीआईके (1 x 108/kgCD3+ कोशिकाओं) जलसेक का परिणाम10प्रकाशित किया गया था ।
वर्तमान अध्ययन में, हमने आईएफएन-ए-, आईएल-1α, एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी और आईएल-2 से बना एक अनुकूलित सेल संस्कृति फार्मूला विकसित किया, जो सीआईके उत्पादन को बढ़ाने के लिए हेमेटोपोइटिक सेल माध्यम में जोड़ा गया, और मानव क्रोनिक के खिलाफ सीआईके कोशिकाओं के साइटोटॉक्सिक प्रभाव की जांच की माइलॉयड ल्यूकेमिया (K562) कोशिकाओं और अंडाशय के कैंसर (ओसी-3) कोशिकाओं।
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Protocol
नैदानिक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया गया और चीन मेडिकल विश्वविद्यालय और अस्पताल अनुसंधान नैतिकता समिति के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशा-निर्देशों के अनुसार मंजूरी दी गई । परिधीय रक्त नमूनों को उनकी सूचित सहमति से स्वस्थ स्वयंसेवकों से काटा गया था ।
1. सामग्री की तैयारी
- सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (एमएसडीएस) में दिखाए गए एजेंटों, एंटीबॉडी और रसायनों को स्टोर करें। दवाओं या साइटोकिनों को स्टॉक समाधान के रूप में सॉल्व करें और फिर भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट करें।
नोट: सामग्री तैयार करने के लिए विस्तृत जानकारी सामग्री की मेजमें उल्लेख किया है ।
2. पीबीएमसी अलगाव
- उपयोग से पहले घनत्व ढाल समाधान(सामग्री की तालिका)को 18-20 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कई बार समाधान की बोतल उलटा।
- एक हेपरिनीकृत शीशी में मानव वेनस रक्त नमूना के 3−5 मिलील लीजिए और धीरे से ट्यूब कई बार उलटा करके अच्छी तरह से मिश्रण।
- 15 मीटर बाँझ ट्यूब में घनत्व ढाल समाधान के 4 mL तैयार करें।
- ध्यान से परत घनत्व ढाल समाधान पर रक्त के नमूने का 1 mL।
- 18−20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज (ब्रेक बंद कर दें)।
- ध्यान से और तुरंत मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (लगभग 1 mL) की बफी कोट परत को एक बार में 1 एमएल बाँझ पिपेट का उपयोग करके बाँझ 15 mL ट्यूब पर परतों को परेशान करने से बचने के लिए एस्पिरेट करें।
- अपकेंद्रित्र ट्यूब में बफी कोट में फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) के कम से कम 3 वॉल्यूम (~ 3 मिलील) जोड़ें। कोशिकाओं को धीरे-धीरे एक बाँझ पिपेट के साथ कम से कम 3x तक और नीचे पिलेट करके निलंबित करें।
- 18−20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। अलौकिक Aspirate।
- बेसल मीडियम(सामग्रीकी तालिका) के 5 mL के साथ सेल पैलेट को निलंबित करें और एक फ्लास्क में स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति।
3. सीआईके इंडक्शन और विस्तार
- 0 दिन, संस्कृति PBMCs (1 x 106)ताजा बेसल माध्यम में १,००० आईयू/आईएफएल युक्त IFN के-एक आर्द्र सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2।
- पहले दिन, एंटी-सीडी3 एंटीबॉडी के ५० एनजी/एमएल वाले ताजा बेसल माध्यम के साथ माध्यम को ताज़ा करें, आरएच आईएल-1α के 1 एनजी/एमएल, और आरएच आईएल-2 के १,००० यू/एमएल । हर 3 दिन में मीडियम को रिफ्रेश करें।
- 7 दिन, आरएच आईएल-2 के १,००० यू/mL युक्त ताजा बेसल माध्यम के साथ माध्यम को ताज़ा करें । सेल विस्तार (दिन 14) के अंत तक हर 3 दिन में माध्यम को ताज़ा करें।
4. सीआईके कोशिकाओं के मूल्यांकन के लिए इम्यूनोफेनोनोटिंग
- बाँझ पीबीएस के 10 mL के साथ CIK कोशिकाओं को धोलें। 300 x जी और 18−20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए सेंट्रलाइज, सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें, और पीबीएस के 10 मीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन परख का उपयोग करके सेल नंबर और परीक्षण सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
- अलीकोट सीआईके कोशिकाओं को ~ 5-10 x 105 कोशिकाओं/एमएल पीबीएस के घनत्व पर छह बाँझ 1.5 मीटर ट्यूबों में उद्धृत करें। लेबल और इस प्रकार के रूप में इलाज: ट्यूब 1, खाली (कोई एंटीबॉडी); ट्यूब 2, आइसोटाइप IgG1-FITC के 20 μL जोड़ें; ट्यूब 3, आइसोटाइप IgG1-APC mAbs के 20 μL जोड़ें; ट्यूब 4, सीडी 3-फ़ेसीसी के 20 माइक्रोन जोड़ें; ट्यूब 5, CD56-APC mAbs के 20 μL जोड़ें; और ट्यूब 6, सीडी 3-फ़ेसीसी के 20 माइक्रोन और सीडी 56-एपीसी एमएबीएस के 20 माइक्रोन जोड़ें।
- धीरे-धीरे सीके कोशिकाओं को एंटीबॉडी के साथ धीरे-धीरे 1 एमएल बाँझ पिपेट के साथ कम से कम 3x पाइपिंग करके मिलाएं, और फिर अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
- 300 x ग्राम और 18−20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। अधिनायक को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार सेल पैलेट को निलंबित करें। धीरे-धीरे उन्हें 1 एमएल बाँझ पिपेट के साथ कम से कम 3x ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- दोहराएं चरण 4.4।
- प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पहले ट्यूबों को अंधेरे में छोड़ दें।
5. सीडी मार्कर मान्यता
- सेल निलंबन को कैप के माध्यम से धीरे-धीरे पाइपिंग करके सेल स्ट्रेनिंग कैप (100 माइक्रोन मेश) के साथ एक बाँझ 5 एमएल पॉलीस्टीरिन राउंड बॉटम ट्यूब पर स्थानांतरित करें। ट्यूबों को हिंडोला पर क्रम में रखें।
- फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस सॉफ्टवेयर खोलें और एक प्रायोगिक फोल्डर बनाएं। प्रयोग में नमूना और ट्यूब जोड़ने के लिए नए नमूना बटन पर क्लिक करें और ट्यूबों को इस प्रकार रखें: ट्यूब 1, ब्लैंक; ट्यूब 2, आइसोटाइप IgG1-CD3; ट्यूब 3, आइसोटाइप IgG1-CD56; ट्यूब 4, सीडी 3; ट्यूब 5, सीडी56; ट्यूब 6, CD3CD56।
- सीआईके सेल आबादी(चित्रा 2ए)के लिए एक स्कैटर गेटिंग सिस्टम बनाएं।
- चुनें Tube 1 (ब्लैंक) और एफएससी-ए/एसएससी-ए प्लॉट बनाने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें । सेल मलबे को बाहर करने के लिए एफएससी-ए सीमा और gt;5 x 104 के साथ पूरी सेल आबादी पर एक आयत गेट खींचें।
- नए डॉट प्लॉट के लिए एसएससी-ए/एसएससी-एच पैरामीटर का चयन करें और सभी एकल कोशिकाओं के चारों ओर एक बहुभुज गेट आकर्षित करें । नए हिस्टोग्राम प्लॉट के लिए क्रमश काउंट/फिईसी (सीडी3) और काउंट/एपीसी (सीडी56) पैरामीटर का चयन करें । नए डॉट प्लॉट के लिए फिटईसी (सीडी3)/एपीसी (सीडी56) पैरामीटर का चयन करें और चार उपआबादी को परिभाषित करने के लिए चार चतुर्भुज गेट आकर्षित करें ।
- प्रत्येक नमूने में 20,000 एकल कोशिकाओं से डेटा रिकॉर्ड करें। पहले ब्लैंक कंट्रोल सैंपल का विश्लेषण करने के लिए लोड सैंपल बटन पर क्लिक करें। CD56 और CD3 चैनल मापदंडों का उपयोग करके पूरे सीआईके सेल आबादी की पहचान करें।
- सभी नमूनों की जांच के लिए चरण 5.3 दोहराएं।
- सीआईके सेल आबादी का विश्लेषण करने और उन्हें विश्लेषण फ़ाइलों में पुनर्मुद्रित करने के लिए व्यक्तिगत नमूने के सांख्यिकीय मूल्यों वाली फाइलों को खोलें।
6. मानव क्रोनिक माइलॉयड ल्यूकेमिया K562 कोशिकाओं और अंडाशय के कैंसर ओसी-3 कोशिकाओं की संस्कृति और धुंधला
- K562 कोशिकाओं
- संस्कृति K562 कोशिकाओं को पूरा मीडिया में (RPMI बेसल माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS] और ५० यू/mL एंटीबायोटिक दवाओं युक्त और एक सेल संस्कृति फ्लास्क में 0.5−1 x 106 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर 4.5 ग्राम/एल के लिए ग्लूकोज समायोजित और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2.
- प्रयोग के दिन 18−20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर 300 x ग्राम पर 300 x ग्राम पर के562 कोशिकाओं वाले संस्कृति मीडिया को स्थानांतरित करें।
- अधिवनात को एस्पिरेट करें, बाँझ पीबीएस के 5 मिलील में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और धीरे-धीरे अच्छी तरह से मिलाएं।
- 10 00 x. अलौकिक के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली, PBS में कोशिकाओं को फिर से निलंबित, और 0.5-1 x 106 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता के लिए K562 कोशिकाओं को समायोजित करें।
- 5 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर 15 मीटर बाँझ ट्यूब में K562 सेल निलंबन के 1 mL में CFSE रंगके के 0.5 μL जोड़ें। धीरे-धीरे निलंबन को कम से कम 3x ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
- ट्यूब को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 10-15 मिन में छोड़ दें।
- ट्यूब के लिए पीबीएस के 9 mL जोड़ें और 10 min के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली। 10 min के लिए दशंट दशंट और फिर पूरा मीडिया के 10 mL में सेल पैलेट को निलंबित करें। सेल निलंबन को सेल कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें और इनक्यूबेटर में रखें।
- ओसी-3 कोशिकाएं
- संस्कृति ओसी-3 कोशिकाएं पूर्ण मीडिया में (DMEM/F12 माध्यम जिसमें 10% एफबीएस और 50 यू/एमएल एंटीबायोटिक्स होते हैं) एक सेल कल्चर फ्लास्क में 0.5-1 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर।
- संस्कृति मीडिया Aspirate और प्रयोग से पहले 1 दिन PBS के साथ कोशिकाओं को धोने ।
- कोशिकाओं को कोशिका विच्छेदन एंजाइम समाधान(सामग्री की तालिका)के 1 mL जोड़कर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें।
- पीबीएस के 5 मिलील जोड़कर कोशिकाओं को निलंबित करें और धीरे-धीरे मिलाएं। 10 00 00 के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली और अलौकिक aspirate। पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं को 0.5-1 x 106 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता में समायोजित करें।
- 5 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर 15 मीटर बाँझ ट्यूब में ओसी-3 सेल निलंबन के 1 mL में CFSE रंगे के 0.5 μL जोड़ें। धीरे-धीरे निलंबन को कम से कम 3x ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
- ट्यूब को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 10-15 मिन में छोड़ दें।
- ट्यूब के लिए PBS के 9 mL जोड़ें और 10 min के लिए ३०० x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली । अतिशयोक्ति को डेडेंट करें और फिर सेल पैलेट को पूर्ण मीडिया के साथ निलंबित करें । बीज 5 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक 6 अच्छी थाली में और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर रात भर ।
7. साइटोटॉक्सिक परख
- सीआईके और K562 कोशिकाओं की सहसंस्कृति (CIK-K562)
- कदम 6.1.7 से K562 कोशिकाओं की गणना करें और नीले बहिष्कार परख ट्राइपैन द्वारा सेल व्यवहार्यता का परीक्षण करें। 5 x 10 5/mL के घनत्व पर 6 अच्छी प्लेट मेंप्रत्येक अच्छी तरह से K562 कोशिकाओं के 1 mL जोड़ें ।
- इस प्रकार चरण 7.1.1 से 6 अच्छी प्लेट में सीआईके कोशिकाओं के साथ या उसके बिना बेसल माध्यम का 1 मिलील जोड़ें: अच्छी तरह से 1 = ब्लैंक, K562 कोशिकाएं अकेले (5 x 105); खैर 2 = CFSE-दाग K562 कोशिकाओं को अकेले (5 x 105); खैर 3 = सीआईके कोशिकाएं (ई [प्रभावक], 25 x 105)+ सीएफएस-दाग K562 कोशिकाओं (टी [लक्ष्य], 5 x 105); खैर 4 = सीआईके कोशिकाएं (ई, 50 x 105)+ सीएफएस-दाग K562 कोशिकाओं (टी, 5 x 105)।
- सेल निलंबन को धीरे-धीरे कम से कम 3x तक और नीचे पिलेट करके मिलाएं। प्लेट को इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए रखें।
- सीआईके और ओसी-3 कोशिकाओं का सहसंस्कृति (सीआईके-ओसी-3)
- इस प्रकार 6.2.7 चरण से 6 अच्छी प्लेट के साथ या सीआईके कोशिकाओं के बिना बेसल माध्यम का 1 एल जोड़ें: अच्छी तरह से 1 = ब्लैंक, ओसी-3 कोशिकाएं अकेले (5 x 105); खैर 2 = CFSE-दाग ओसी-3 कोशिकाओं अकेले (5 x 105); खैर 3 = सीआईके कोशिकाएं (ई, 25 x 105)+ सीएफएस-दाग ओसी-3 कोशिकाएं (टी, 5 x 105); खैर 4 = सीआईके कोशिकाएं (ई, 50 x 105)+ सीएफएस-दाग ओसी-3 कोशिकाएं (टी, 5 x 105)।
- सेल निलंबन को धीरे-धीरे कम से कम 3x तक और नीचे पिलेट करके मिलाएं। प्लेट को इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए रखें।
- 7-अमीनोऐक्टिनोमाइसिन डी (7-AAD) रंग धुंधला
- सीके-K562 सेल निलंबन को चरण 7.1.3 से सीधे 15 मिलील बाँझ ट्यूब में काटें।
- चरण 7.2.2 से सीआईके-ओसी-3 समूहों से निलंबन और अनुयायी कोशिकाओं दोनों को काटें।
- सेल निलंबन को 15 मीटर बाँझ ट्यूब पर स्थानांतरित करें। बाँझ PBS के 1 mL के साथ अच्छी तरह से धोएं, पीबीएस इकट्ठा करें, और ट्यूब में जोड़ें। सेल विघटन एंजाइम समाधान के 0.5 mL जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट।
- इसी अच्छी तरह से एक ही ट्यूब से समाधान का 1 mL जोड़ें और धीरे से उन्हें पाइपिंग करके कोशिकाओं को मिलाएं और कम से कम 3x को 1 मिलीस बाँझ पिपेट के साथ नीचे करें। सभी कोशिकाओं को एक ही ट्यूब में एकत्र करें।
- 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें, और बाँझ पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली, सुपरनेटेंट aspirate, और बाँझ PBS के 100 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
- सेल निलंबन में 7-AAD dye (50 एनजी/μL स्टॉक) के 5 माइक्रोन जोड़ें। धीरे-धीरे कोशिकाओं को 1 मिलीकर बाँझ पिपेट के साथ कम से कम 3x तक और नीचे मिलाएं। 10 मिन के लिए इनक्यूबेट और विश्लेषण से पहले अंधेरे में छोड़ दें।
- साइटोलिटिक क्षमता परख
- सेल निलंबन को चरण 7.3.4 से मिलाएं और एक बार चरण 5.1 और 5.2 दोहराएं।
- प्रयोग में नमूना और ट्यूब जोड़ने के लिए नए नमूना बटन पर क्लिक करें और ट्यूबों को इस प्रकार रखें: ट्यूब 1, K562 (या OC-3) कोशिकाएं; ट्यूब 2, CFSE-दाग K562 (या ओसी-3) कोशिकाओं ही; ट्यूब 3, ई:टी = 5:1; ट्यूब 4, ई:टी = 10:1।
- साइटोलिटिक परख(चित्रा 3ए)के लिए एक स्कैटर गेटिंग सिस्टम बनाएं।
- ट्यूब 1 का चयन करें और एफएससी-ए/एसएससी-ए प्लॉट बनाने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें । सेल मलबे को बाहर करने के लिए एफएससी-ए थ्रेसहोल्ड एंड जीटी5 x 104 के साथ सभी घटनाओं पर एक आयत गेट खींचें।
- नए डॉट प्लॉट के लिए एसएससी-ए/सीएफएसई पैरामीटर का चयन करें। नए डॉट प्लॉट के लिए 7-AAD/CFSE पैरामीटर का चयन करें और चार उपआबादी को परिभाषित करने के लिए चार चतुर्भुज गेट आकर्षित करें ।
- पहले ब्लैंक कंट्रोल सैंपल का विश्लेषण करने के लिए लोड सैंपल बटन पर क्लिक करें।
- एसएससी-ए और एफएससी-ए के वोल्टेज को एडजस्ट करें। सीएफएसई और 7-एएडी चैनल मापदंडों का उपयोग करके मृत सेल आबादी की पहचान करें। प्रत्येक नमूने में >20,000 CFSE+ कोशिकाओं से डेटा रिकॉर्ड करें।
- सभी नमूनों की जांच के लिए धारा 7.4.6 दोहराएं।
- गैर-व्यवहार्य सेल आबादी का विश्लेषण करने और डेटा को विश्लेषण फ़ाइलों में निर्यात करने के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने के सांख्यिकीय मूल्यों वाली फाइलों को खोलें।
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Representative Results
वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य परिधीय रक्त मोनोसाइट्स से साइटोकिन-प्रेरित हत्यारा (सीआईके) टी कोशिकाओं को अलग करना और विस्तारित करना और क्रमशः हेमेटोलॉजिकल द्रोह और ठोस कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ सीआईके के साइटोटॉक्सिक प्रभाव का मूल्यांकन करना है। सीके को शामिल करने की पहचान सीडी3/सीडी56 मान्यता से हुई थी। चित्रा 1ए सीआईके इंडक्शन और विस्तार के लिए प्रोटोकॉल दिखाता है। स्वस्थ दानदाताओं से CD3+CD56+ टी कोशिकाओं की उपजनसंख्या का विश्लेषण करने के लिए गेटिंग रणनीति के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1बीमें सचित्र है । चित्रा 1सी तीन व्यक्तियों से सीआईके अनुपात के सांख्यिकीय विश्लेषण को दर्शाता है।
चित्रा 2ए से पता चलता है कि सीडी 3+सीडी56+ सेल अनुपात (मूल पीबीएमसी के लिए 0.65%), निचले पैनल को छोड़ दिया और 14दिन,दाएं निचले पैनल पर काटे गए सीआईके कोशिकाओं के लिए 27.4% विस्तार के 14 दिनों के बाद काफी वृद्धि हुई। हमारी संस्कृति प्रणाली में, सीआईके कोशिकाओं ने पीबीएमसी(चित्रा 2बी)की मूल संख्या की तुलना में लगभग आधा सौ गुना परिवर्तन किए।
चित्रा 3 मानव क्रोनिक माइलॉयड ल्यूकेमिया K562 कोशिकाओं और मानव अंडाशय कैंसर ओसी-3 कोशिकाओं के खिलाफ CIK के साइटोटॉक्सिक प्रभाव से पता चलता है । K562 या OC-3 कोशिकाओं (लक्ष्य, टी) एक गैर फ्लोरोसेंट रंग (CFSE), जो व्यवहार्य कोशिकाओं के भीतर इंट्रासेलुलर esterases द्वारा cleaved था और फिर एक अत्यधिक फ्लोरोसेंट रंगा बन गया के साथ दाग थे । साइटोटॉक्सिक सहसंस्कृति अध्ययन में, सीएफएसई-दाग K562 या ओसी-3 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सीआईके कोशिकाओं के साथ सहउपचार ित किया गया था। ऊष्मायन के अंत में, कुल कोशिकाओं को काटा गया और 7-AAD रंगे के साथ दाग दिया गया, जो एक न्यूक्लिक एसिड-बाध्यकारी रंग है जिसे मृत कोशिका बहिष्कार के लिए व्यवहार्यता जांच के रूप में उपयोग किया जाता है। सीआईके और सीएफएसई+ कोशिकाओं के आकार और दानेदारता को चित्र 3एमें दर्शाया गया है । सीएफएसई-दाग K562 कोशिकाओं (लक्ष्य कोशिकाओं, टी) को क्रमशः ई/टी = 0:1, 5:1 और 10:1 के अनुपात में सीआईके कोशिकाओं (प्रभावक कोशिकाओं, ई) के साथ सह-उपचार किया गया था। सीएफएसई+ K562 कोशिकाओं की 7-AAD+ कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था। सांख्यिकीय परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से थे । बेसल लिसिस का अर्थ है प्रभावक कोशिकाओं (ई:टी = 0:1) के अभाव में कोशिका मृत्यु का प्रतिशत। चित्रा 3बी ओसी-3 कोशिकाओं (ई: टी = 10:1) के खिलाफ सीआईके की स्पष्ट साइटोटॉक्सिकिसिटी को 24 एच के ऊष्मायन के बाद दिखाता है।
चित्रा 1: साइटोकिन-प्रेरित हत्यारा कोशिकाओं के प्रवाह चार्ट प्रेरण और विस्तार। (ए)सहमति से स्वस्थ दाताओं से PBMCs शुरू में rhIFN-के लिए उजागर किया गया-(दिन 0), rhIL-2, rhIL-1α, और विरोधी CD3 mAb (दिन 1) हर 3 दिन (दिन 4) के बाद । बाद में, माध्यम को हर 3 दिन में RHIL-2-युक्त माध्यम के साथ ताजा किया गया था और 14 दिन कोशिकाओं को काटा गया था । (ख)इंडक्शन के 7 दिनों के दौरान सीआईके कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। प्रोटोकॉल में वर्णित सीआईके कोशिकाओं की सक्रियण और विस्तार का आयोजन किया गया था। कोशिकाओं को क्रमशः 1, 5 और 7 दिन पर एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया (आवर्धन = 40x, स्केल बार = 200 माइक्रोन)। (ग)सेल काउंट साप्ताहिक प्रदर्शन किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एक प्रतिनिधि PBMC नमूने से CD3+CD56+ टी कोशिकाओं का अनुपात। (A)लिम्फोसाइट्स को विशिष्ट आकार और दानेदारता द्वारा पहचाना जाता था। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए चयनित एकल कोशिका आबादी। (ख)तीन स्वस्थ दानदाताओं से सीआईके विस्तार प्रभावकारिता का सांख्यिकीय विश्लेषण टी-टेस्ट (*, पी एंड एलटी; ०.०१) का उपयोग करके किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: मानव क्रोनिक माइलॉयड ल्यूकेमिया K562 और मानव अंडाशय कैंसर ओसी-3 कोशिकाओं के खिलाफ CIK कोशिकाओं के साइटोटॉक्सिक प्रभाव। (क)24 घंटे के लिए सीआईके कोशिकाओं के साथ सहसंस्कृति के बाद, K562 लक्ष्य कोशिकाओं को पहचाना गया और सीएफएसई डाये के धुंधला होने के आधार पर गेट किया गया । चयनित 7-AAD/CFSE पैरामीटर के तहत कुल सेल आबादी का चक्रात्मक चित्रण और इंगित ई:टी अनुपात में सीआईके कोशिकाओं की संचयी साइटोटॉक्सिकिटी । (ख)ई: टी = 10:1 अनुपात में ओसी-3 कोशिकाओं के खिलाफ सीआईके कोशिकाओं का साइटोटॉक्सिक प्रभाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
वर्णित विधि स्वस्थ दाताओं के पूरे रक्त नमूनों से साइटोटॉक्सिक साइटोकिन-प्रेरित हत्यारा (सीआईके) टी कोशिकाओं के अलगाव और विस्तार के लिए एक तेज, सुविधाजनक और विश्वसनीय प्रोटोकॉल है। यह फ्लो साइटोमेट्री सेटअप और ट्रैकिंग (सीएस एंड टी) सिस्टम का उपयोग करके ल्यूकेमिया (K562) और ओवेरियन कैंसर कोशिकाओं (ओसी-3) के खिलाफ सीआईके के साइटोटॉक्सिक प्रभाव को भी दिखाता है। सीआईके कोशिकाओं को आगे नैदानिक जलसेक11के लिए जीएमपी-ग्रेड साइटोकिन्स और सीरम-मुक्त माध्यम का उपयोग करके अच्छी मनुफैक्टरी प्रथाओं (जीएमपी) स्थितियों में प्रेरित और विस्तारित किया जा सकता है। हालांकि, सीआईके इंडक्शन और विस्तार की प्रभावकारिता व्यक्तिगत मतभेदों कोदर्शातीहै 12 ,13,14। इसके अलावा, कैंसर सेल थेरेपी के लिए रोगी-व्युत्पन्न सीआईके कोशिकाओं के जलसेक का लाभ सुरक्षा है। यह बताया गया है कि सीआईके कोशिकाएं अधिकांश एनकेजी2डी-निर्भर तरीके से एपिथेलियल ठोस कैंसर कोशिकाओं पर साइटोलिटिक प्रभाव डालती हैं। हेमेटोलॉजिकल कैंसर कोशिकाओं में, एनकेजी2डी को एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध करना एनकेजी2डी-कम K562 कोशिकाओं के खिलाफ सीआईके-प्रेरित साइटोटॉक्सिकिटी को काफी रोकता है; हालांकि, इस उपचार एचएल-60 NKG2D15कमी कोशिकाओं पर कोई प्रभाव नहीं है . इसके अलावा, सीआईके कोशिकाएं सीडी 8+ सीआईके कोशिकाओं16की तुलना में K562 कोशिकाओं के खिलाफ कम सेल-किलिंग गतिविधि प्रदर्शित करती हैं। इस अध्ययन में, हमने पाया कि सीआईके ने ल्यूकेमिया K562 कोशिकाओं की तुलना में ओवेरियन कैंसर ओसी-3 कोशिकाओं के खिलाफ अधिक साइटोटॉक्सिक क्षमता का प्रदर्शन किया। इन आंकड़ों से पता चलता है कि सटीक आणविक तंत्र जिसके माध्यम से सीआईके प्रभावक ट्यूमर कोशिकाओं को मारते हैं, अभी तक स्पष्ट नहीं हैं।
लक्ष्य सेल व्यवहार्यता पर नज़र रखना और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके प्रभावक कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिक क्षमता का मूल्यांकन नैदानिक परीक्षा17के लिए एक मानक और पारंपरिक विधि बन गया है । यह सुझाव दिया गया है कि सेल व्यवहार्यता और सक्रियण मार्कर की अभिव्यक्ति पर नकारात्मक प्रभाव देखा जाता है, जैसे सीसीएफएई में सीडी 3+ आबादी-18,19के साथ सीएफएसई-दाग लिम्फोसाइट्स। इस प्रकार, लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं धुंधला प्राथमिक CIK कोशिकाओं के साइटोटॉक्सिक प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक अधिक प्रभावी रणनीति है। आईएफएन-ए, ओकेटी 3 और आईएल-2 सीआईके भेदभाव और प्रसार के लिए प्रमुख साइटोकिन्स या उत्तेजक हैं। इसके अलावा, थाइमोग्लोबुलिन, आईएल-1α, आईएल-10, आईएल-15 जैसे अन्य कारक भी उत्तेजक हैं। वर्तमान में, मानव सीरम, मानव प्लेटलेट से भरपूर प्लाज्मा, और यहां तक कि भ्रूण गोजातीय सीरम का उपयोग मध्यम पूरक के रूप में किया जाता है जो सीआईके कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ा सकता है। यद्यपि सीरम या प्लाज्मा पोषक तत्वों और विकास कारकों से समृद्ध होते हैं, लेकिन एलोजेनिक पशु उत्पादों के अलावा स्रोत, बैच और बहुत भिन्नताएं प्रस्तुत होती हैं जो प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता में परिणाम देते हैं, और सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए चिकित्सीय परिणामों के साथ अनिवार्य रूप से डिस्टर्ब अध्ययन करते हैं। इस अध्ययन में, हमने सीआईके कोशिकाओं को सफलतापूर्वक संस्कृति के लिए नैदानिक ग्रेड साइटोकिन्स के साथ पूरक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीरम-मुक्त, एल्बुमिन-मुक्त और ज़ेनो-मुक्त जीएमपी-ग्रेड मीडिया का उपयोग किया। ज़ेनो-मुक्त या एलोजेनिक-मुक्त खुराक का उपयोग करने का नुकसान यह है कि वे कोशिका प्रसार की प्रभावकारिता को कम करते हैं।
प्रोटोकॉल में प्रदान किए गए दो-रंग सेल ट्रैकिंग विधियों ने स्वतंत्र रूप से प्रत्यक्ष साइटोटॉक्सिकपरेय परख में व्यवहार्य या मृत प्रभावक लक्ष्य कोशिकाओं की गणना की। हमारी गेटिंग रणनीतियों में, सीएफएसई+ लक्ष्य कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से सीआईके प्रभावक कोशिकाओं(चित्रा 3)से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, सीआईके प्रेरण और विस्तार की प्रक्रिया योग्य होनी चाहिए और उच्च व्यवहार्यता दिखानी चाहिए। आगे कई खुराक सुई के लिए, क्रायोप्रिजर्वेशन की स्थिति, और व्यवहार्यता और विगलन के बाद साइटोटॉक्सिकिता, अन्य महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं। विशिष्ट लाइसिस का वास्तविक अनुपात 100 x (% नमूना लाइसिस - %Basal lysis) /(100 - %Basal lysis) के अनुपात के बराबर है। 18,20अन्य अध्ययनों के विपरीत, यह सिफारिश की जाती है कि सभी लक्षित कोशिकाओं की जांच की जाए ताकि सीआईके कोशिकाओं की सटीक और वास्तविक साइटोटॉक्सिकिटी को प्रकट किया जा सके।
निष्कर्ष में, इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल स्वस्थ दाताओं से PBMC-व्युत्पन्न CIK कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने के लिए और चयनात्मक ट्रैकिंग के लिए दो रंग फोटोएक्टिवेट जांच के साथ कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ अपने साइटोटॉक्सिक कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है इन विट्रो डायग्नोस्टिक (आईवीडी) सिस्टम के साथ फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं को लक्षित करें।
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Disclosures
लेखक वित्तीय हितों के कोई प्रतिस्पर्धी संघर्ष की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
इस अध्ययन को चाइना मेडिकल यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल (डीएमआर-सेल-1809) ने सपोर्ट किया।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | |
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | |
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | |
D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | |
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 |
Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Proleukin | NOVARTIS | ||
Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | |
Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | |
RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | |
Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | |
X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q |
References
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