Aislamiento y expansión de células T asesinas inducidas por citoquinas citotóxicas para el tratamiento del cáncer
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para realizar el aislamiento y expansión de células mononucleares de sangre periférica-inducidas por citoquinas CD3+CD56+ células asesinas e ilustrar su efecto de citotoxicidad contra las células cancerosas hematológicas y sólidas mediante el uso de un sistema de citometría de flujo de diagnóstico in vitro.
Abstract
La inmunoterapia celular adoptiva se centra en restaurar el reconocimiento del cáncer a través del sistema inmunitario y mejora la matanza efectiva de células tumorales. Se ha informado que la terapia con células T por el asesino de citoquinas (CIK) ejerce efectos citotóxicos significativos contra las células cancerosas y reduce los efectos adversos de la cirugía, la radiación y la quimioterapia en los tratamientos oncológicos. El CIK se puede derivar de células mononucleares de sangre periférica (PPBM), médula ósea y sangre del cordón umbilical. Las células CIK son una subpoblación heterogénea de células T con CD3+CD56+ y características fenotípicas de asesino natural (NK) que incluyen actividad antitumoral no restringida del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). Este estudio describe un método calificado, clínicamente aplicable, basado en citometría de flujo para la cuantificación de la capacidad citolítica de las células CIK derivadas de PBMC contra células cancerosas hematológicas y sólidas. En el ensayo citolítico, las células CIK se entrenan en diferentes proporciones con células tumorales diana prestadas. Después del período de incubación, el número de células diana se determina mediante una mancha de unión a ácido nucleico para detectar células muertas. Este método es aplicable tanto a aplicaciones de investigación como de diagnóstico. Las células CIK poseen una potente citotoxicidad que podría ser explorada como una estrategia alternativa para el tratamiento del cáncer tras su evaluación preclínica mediante una configuración y seguimiento del citometro (cS y T) sistema de citometría de flujo basado.
Introduction
Los linfocitos T citotóxicos son una población específica de células efectogenitas inmunes que media respuestas inmunitarias contra el cáncer. Varias poblaciones de células efectoras, incluidas las células asesinas activadas por linfina (LAK), los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL), las células asesinas naturales (NK), las células T y las células asesinas inducidas por citoquinas (CIK), se han desarrollado con fines de terapia adoptiva de células T (ACT)1. Existe un creciente interés en las células CIK, ya que representan una mezcla de poblaciones de células citotóxicas inducidas por citoquinas expandidas a partir de células mononucleares de sangre periférica autóloga (PMBC)2.
El crecimiento incontrolado de células progenitoras linfoides, mieloblastos y linfoblastos conduce a tres tipos principales de cánceres de sangre (es decir, leucemia, linfoma y mieloma), tumores sólidos, incluyendo carcinomas (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino) y sarcomas, entre otros cánceres3. Las células CIK son una mezcla de poblaciones celulares que presentan una amplia gama de actividad antitumoral no restringida del complejo de histocompatibilidad (MHC) y, por lo tanto, son prometedoras para el tratamiento de tumores hematológicos y avanzados4,5,6,7. Las células CIK comprenden una combinación de células, incluyendo células T (CD3+CD56), celdas NK-T (CD3+CD56+), y celdas NK (CD3–CD56+). La optimización del protocolo de inducción CIK mediante el uso de un cronograma fijo para la adición de anticuerpos IFN-o, anti-CD3 e IL-2, da como resultado la expansión de las células CIK8. La capacidad citotóxica de las células CIK contra las células cancerosas depende principalmente de la participación del grupo NK 2 miembro D (un miembro de la familia de receptores similares a la lectina de tipo C) ligandos NKG2D en las células tumorales, y en las vías mediadas por perforina9. Los resultados de un estudio preclínico revelaron que las células CIK estimuladas por IL-15 indujeron citotoxicidad potente contra las líneas celulares de leucemia mieloide primaria sin efecto sin vitro y mostraron una menor aleeactividad contra los PBMU normales y los fibroblastos9. Recientemente, se publicó el resultado de la perfusión de CIK de un donante sano (1 x 108/kg CD3+ células) como consolidación tras el trasplante alogénico no mieloablativo para el tratamiento de neoplasias mieloides en un estudio clínico de fase II10.
En el presente estudio, desarrollamos una fórmula de cultivo celular optimizada compuesta por IFN-, IL-1, anticuerpo anti-CD3 e IL-2 añadido al medio celular hematopoyético para aumentar la producción de CIK, e investigamos el efecto citotóxico de las células CIK contra la crónica humana leucemia mieloide (K562) y células de cáncer de ovario (OC-3).
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito es un protocolo rápido, conveniente y confiable para el aislamiento y expansión de células T asesinas de citoquinas (CIK) inducidas por citoquinas (CIK) de muestras de sangre entera de donantes sanos. También muestra el efecto citotóxico de CIK contra la leucemia (K562) y las células cancerosas de ovario (OC-3) utilizando un sistema de configuración y seguimiento de citometría de flujo (CS & T). Las células CIK pueden ser inducidas y ampliadas en buenas prácticas de fabricación (GMP) median…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Hospital Universitario Médico de China (DMR-Cell-1809).
Materials
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | ||
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | SN: R33896202856 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | Basal medium for OC-3 cell culture | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | Density gradient solution | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 | |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 | Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C. | |
| Proleukin | NOVARTIS | Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | ||
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q | Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C |
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