We presenteren een algemeen protocol voor het identificeren van korte stukken van homologe gastheer-pathogen eiwit sequenties (SSHHP’S) ingebed in de virale poly eiwit. SSHHP’S worden herkend door virale proteasen en richten de gerichte vernietiging van specifieke gastheer proteïnen op door verschillende groep IV virussen.
Alphavirale enzymen worden gesynthetiseerd in één polypeptide. De niet structureel poly protein (NSP) wordt verwerkt door zijn nsP2 cysteïne protease om actieve enzymen te produceren die essentieel zijn voor virale replicatie. Virale proteasen zijn zeer specifiek en herkennen gekonveerde decolleté site motief sequenties (~ 6-8 aminozuren). In verschillende groep IV virussen, de nsP protease (s) decolleté site Motif sequenties kunnen worden gevonden in specifieke gastheer eiwitten die betrokken zijn bij het genereren van de aangeboren immuunresponsen en, in sommige gevallen, de beoogde eiwitten lijken te worden gekoppeld aan het virus-geïnduceerde fenotype. Deze virussen maken gebruik van korte stukken van homologeuze gastheer-pathogen-eiwit sequenties (SSHHP’S) voor gerichte vernietiging van gastheer eiwitten. Om sshhp’s te identificeren kan de virale protease decolleté site Motif sequenties worden ingevoerd in blast en de gastheer genoom (s) kan worden doorzocht. Decolleté kan in eerste instantie worden getest met behulp van de gezuiverde nsP virale protease en fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) substraten gemaakt in E. coli. De FRET substraten bevatten cyaan en gele fluorescerende eiwitten en de decolleté site sequentie (CFP-sequentie-YFP). Deze protease test kan continu worden gebruikt in een plaat lezer of discontinu in SDS-PAGE gels. Modellen van de gebonden peptide substraten kunnen in silico worden gegenereerd om substraat selectie en mutagenese studies te begeleiden. CFP/YFP substraten zijn ook gebruikt om te identificeren van proteaseremmers. Deze in vitro en in silico-methoden kunnen worden gebruikt in combinatie met assays op basis van cellen om te bepalen of de beoogde host-proteïne van invloed is op virale replicatie.
Bewijs van horizontale genoverdracht van virus naar host, of host to virus, kan worden gevonden in een verscheidenheid van genomen1,2,3,4. Voorbeelden van virale endogenisatie zijn de crispr spacer sequenties gevonden in bacteriële gastheer genomen4. Onlangs hebben we bewijs gevonden van gastheer eiwit sequenties ingebed in de niet-structurele poly proteïnen van (+) ssRNA groep IV virussen. Deze sequenties binnen de codeer gebieden van het virale genoom kunnen generationeel worden vermeerderd. De korte stukken van homologeuze gastheer-pathogen eiwit sequenties (sshhp’s) zijn te vinden in het virus en gastheer5,6. Sshhp’s zijn de gekligeerde decolleté-site-Motif sequenties die worden herkend door virale proteasen die homologie hebben aan specifieke gastheer eiwitten. Deze sequenties direct de vernietiging van specifieke gastheer eiwitten.
In onze vorige publicatie6hebben we een lijst samengesteld van alle gastheer eiwitten die werden doelwit van virale proteasen en ontdekten dat de lijst met doelen niet-willekeurig was (tabel 1). Er waren twee trends zichtbaar. Ten eerste behoorde het merendeel van de virale proteasen die gastheer eiwitten knippen tot groep IV virussen (24 van de 25 gevallen betrokken groep IV virale proteasen), en een protease behoorde tot de (+) ssRNA groep VI retrovirussen (HIV, humaan immunodeficiëntie virus)7. Ten tweede waren de eiwit doelen van de gastheer die door de virale proteasen werden gesneden in het algemeen betrokken bij het genereren van de aangeboren immuunresponsen die suggereerden dat de decolleté bedoeld waren om de immuunresponsen van de gastheer te antagoniseren. De helft van de gastheer eiwitten doelwit van de virale proteasen waren bekende componenten van signalering van Cascades die interferon (IFN) en proinflammatoire cytokines genereren (tabel 1). Anderen waren betrokken bij de transcriptie van host cellen8,9,10 of vertaling11. Belangwekkend, Shmakov et al.4 hebben aangetoond dat veel crispr protospacer sequenties corresponderen met genen die betrokken zijn bij plasmide conjugatie of replicatie4.
Groep IV omvat onder andere de Flaviviridae, de Picornaviridae, de Coronaviridae, de Calciviridae en de togaviridae. Verschillende nieuwe en opkomende pathogenen behoren tot groep IV zoals het Zikavirus (ZIKV), West Nile (WNV), chikungunya (CHIKV), ernstig acuut respiratoir syndroom virus (SARS) en Middle East respiratoir syndroom (MERS). Het (+) ssRNA genoom is in wezen een stukje mRNA. Om de enzymen te produceren die nodig zijn voor genoom replicatie moet het (+) ssRNA genoom eerst worden vertaald. In alphavirussen en andere groep IV virussen, de enzymen die nodig zijn voor de replicatie worden geproduceerd in een enkel poly eiwit (dat wil zeggen, nsP1234 voor VEEV). De niet-structurele poly proteïne (nsP) is proteolytisch verwerkt (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) door de nsP2 protease voor de productie van actieve enzymen12 (Figuur 1). Decolleté van de poly proteïne door de nsP2 protease is essentieel voor virale replicatie; Dit is aangetoond door verwijdering en op de site gerichte mutagenese van de actieve site cysteïne van de nsP2 protease13,14. Met name de vertaling van virale eiwitten voorafgaat aan genoom replicatiegebeurtenissen. NsP4 bevat bijvoorbeeld de RNA-afhankelijke RNA-polymerase die nodig is om het (+) ssRNA-genoom te repliceren. Genoom replicatie kan dsRNA-Intermediates produceren; deze tussen producten kunnen de aangeboren immuunresponsen van de gastheer activeren. Dus, deze virussen kunnen klieven gastheer aangeboren immuunrespons eiwitten vroeg in de infectie om hun effecten te onderdrukken15,16,17.
Silencing kan optreden op het niveau van DNA, RNA en eiwitten. Wat voor elk van de in Figuur 1 getoonde geluids dempings mechanismen gebruikelijk is, is dat korte vreemde DNA-, RNA-of eiwit sequenties worden gebruikt om de vernietiging van specifieke doelen te begeleiden om hun functie te antagoniseren. De geluidsdempende mechanismen zijn analoog aan Programma’s voor zoeken en verwijderen die in drie verschillende talen zijn geschreven. De korte decolleté site sequentie is analoog aan een “keyword”. Elk programma heeft een enzym dat de overeenkomst herkent tussen de korte reeks (het “trefwoord”) en een woord in het “bestand” dat moet worden verwijderd. Zodra een overeenkomst wordt gevonden, het enzym snijdt (“verwijdert”) de grotere doel volgorde. De drie in Figuur 1 getoonde mechanismen worden gebruikt om de gastheer te verdedigen tegen virussen, of om een virus te verdedigen tegen het immuunsysteem van een gastheer.
Virale proteasen herkennen korte decolleté site Motif sequenties tussen ~ 2-11 aminozuren; in nucleotiden komt dit overeen met 6-33 basissen. Ter vergelijking, crispr spacer sequenties zijn ~ 26-72 nucleotiden en RNAi zijn ~ 20-22 nucleotiden18,19. Hoewel deze sequenties relatief kort zijn, kunnen ze specifiek worden herkend. Gezien de hogere diversiteit van aminozuren, is de waarschijnlijkheid van een willekeurig decolleté-evenement relatief laag voor een virale protease die eiwit sequenties van 6-8 aminozuren of langer herkent. De voorspelling van SSHHP’S in gastheer eiwitten zal grotendeels afhangen van de specificiteit van de virale protease die wordt onderzocht. Als de protease strikte sequentie specificiteits vereisten heeft, is de kans op het vinden van een decolleté site sequentie 1/206 = 1 in 64.000.000 of 1/208 = 1 in 25.600.000.000; de meeste proteasen hebben echter variabele subsite toleranties (bijvoorbeeld R of K kan worden getolereerd op de S1-site). Daarom is er geen vereiste voor de sequentie-identiteit tussen de reeksen gevonden in de host versus het virus. Voor virale proteasen met lossere sequentie vereisten (zoals die van Picornaviridae) kan de kans op het vinden van een decolleté plaats in een gastheer eiwit hoger zijn. Veel van de vermeldingen in tabel 1 zijn afkomstig uit de familie Picornaviridae .
Schechter & Berger notatie20 wordt vaak gebruikt om de residuen in een protease substraat en de subsites waaraan ze binden te beschrijven, we gebruiken deze notatie overal. De residuen in het substraat die N-terminal van de scissile binding zijn worden aangeduid als P3-P2-P1 terwijl die C-terminal worden aangeduid als P1′-P2′-P3 ‘. De corresponderende subsites in de protease die deze aminozuurresiduen binden zijn S3-S2-S1 en S1′-S2’-S3 ‘, respectievelijk.
Om te bepalen welke host-eiwitten worden getarget, kunnen we SSHHP’S identificeren in de decolleté van virale polyprotein-sites en zoeken naar de gastheer eiwitten die ze bevatten. Hierin schetsen we procedures voor het identificeren van sshhp’s met behulp van bekende virale protease decolleté site sequenties. De bioinformatische methoden, protease-assays en in de beschreven silico-methoden zijn bedoeld om te worden gebruikt in combinatie met assays op basis van cellen.
Sequentie-overeenstemmingen van de gastheer eiwitten die worden getarget door virale proteasen hebben soortspecifieke verschillen onthuld binnen deze korte decolleté site sequenties. Bijvoorbeeld, het Venezolaanse Equine encefalitis virus (veev) nsP2 protease bleek te snijden menselijke TRIM14, een tripartiete motief (Trim) eiwit6. Sommige TRIM proteïnen zijn virale restrictie factoren (bijv. TRIM5α21), de meeste worden verondersteld ubiquitine E3 ligases te zijn. TRIM14 mist een RING (echt interessant nieuw gen) domein en wordt niet beschouwd als een E3 ligase22. TRIM14 is voorgesteld een adapter te zijn in de mitochondriale antivirale signalosome (MAVS)22, maar kan andere antivirale functies hebben23. Uitlijning van TRIM14 sequenties van verschillende soorten toont aan dat paarden niet de decolleté site en haven een afgeknotte versie van TRIM14 die het C-Terminal PRY/SPRY-domein mist. Dit domein bevat een polyubiquitination site (afbeelding 2). In paardachtigen zijn deze virussen zeer dodelijk (~ 20-80% sterfte) terwijl bij mensen slechts ~ 1% sterven aan VEEV-infecties24. Decolleté van het PRY/SPRY-domein kan de MAVS-signalerings Cascade transitief kortsluiting. Deze Cascade kan worden geactiveerd door dsRNA en leidt tot de productie van interferon en pro-inflammatoire cytokines. De aanwezigheid van de SSHHP’S kan dus nuttig zijn om te voorspellen welke soorten verdedigingssystemen hebben tegen specifieke groep IV-virussen.
In groep IV virussen, IFN antagonisme mechanismen worden verondersteld te vermenigvuldigen redundant25. Host Protein decolleté kan van voorbijgaande aard zijn tijdens infectie en concentraties kunnen na verloop van tijd herstellen. We vonden in cellen dat TRIM14 decolleté producten zeer vroeg kunnen worden gedetecteerd na trans fectie (6 h) met een plasmide coderen van de protease (cytomegalovirus promotor). Bij langere periodes werden de splijting producten echter niet gedetecteerd. In virus geïnfecteerde cellen waren de kinetiek verschillend en konden decolleté producten worden gedetecteerd tussen 6-48 h6. Anderen hebben het uiterlijk van gastheer eiwit splijting producten gemeld al in 3-6 h post infectie9,11.
Proteolytische activiteit in cellen is vaak moeilijk te vangen; de splijting producten kunnen variëren in hun oplosbaarheid, concentratie, stabiliteit en levensduur. In op cellen gebaseerde testen kan niet worden aangenomen dat splijting producten zich in een cel zullen ophopen of dat de band intensiteiten van cut en Onbesneden proteïne compenserende verhogingen en dalingen zullen vertonen, aangezien het snij eiwit zeer snel kan worden afgebroken en mogelijk niet detecteerbaar is in een Western-Blot met een verwacht molecuulgewicht (MW) (bijv. de regio met de epitoop kan worden gespleten door andere gastheer proteasen of kunnen worden alomtegenwoordig). Als het substraat van de virale protease een aangeboren immuunrespons-eiwit is, kan de concentratie ervan variëren tijdens infectie. Bijvoorbeeld, sommige aangeboren immuunrespons eiwitten zijn aanwezig vóór virale infectie en worden verder geïnduceerd door interferon26. De concentratie van het doeleiwit kan daarom fluctueren tijdens infectie en vergelijking van niet-geïnfecteerde vs. geïnfecteerde cellysaten kan moeilijk te interpreteren zijn. Bovendien zijn alle cellen mogelijk niet gelijkmatig getransfuneerd of geïnfecteerd. In vitro protease assays met behulp van gezuiverde eiwitten van E. coli aan de andere kant hebben minder variabelen waarvoor te controleren en dergelijke testen kunnen worden gedaan met behulp van SDS-page in plaats van immunoblots. Contaminerende proteasen kunnen worden geremd in de vroege stappen van de eiwit zuivering van het GVB/YFP substraat, en gemuleerde virale proteasen kunnen worden gezuiverd en getest als controles om te bepalen of het decolleté te wijten is aan het virale protease of een contaminerende bacteriële protease.
Een beperking van in vitro protease-assays is dat ze de complexiteit van een zoogdier cel missen. Voor een enzym om zijn substraat te snijden, moeten de twee worden co-gelokaliseerd. Groep IV virale proteasen verschillen in structuur en lokalisatie. Bijvoorbeeld, de ZIKV protease is ingebed in het endoplasmisch reticulum (ER) membraan en kijkt naar de cytosol, terwijl de VEEV nsP2 protease is een oplosbare proteïne in het cytoplasma en Nucleus27. Sommige van de decolleté site sequenties gevonden in de ZIKV SSHHPS analyse waren in signaal peptiden suggereren dat decolleté co-translationally voor sommige doelen optreden kan. In deze analyses moet dus ook rekening worden gehouden met de locatie van het protease en het substraat in de cel.
Assays op basis van cellen kunnen waardevol zijn voor het vaststellen van een rol voor de geïdentificeerde gastheer-eiwit (en) in infectie. Methoden die erop gericht zijn virale protease splitsing van gastheer proteïnen te stoppen, zoals de toevoeging van een proteaseremmer6 of een mutatie in het hostdoel16 , kunnen worden gebruikt om de effecten ervan op virale replicatie te onderzoeken. Overexpressie van het beoogde eiwit kan ook invloed hebben op virale replicatie28. Plaque-assays of andere methoden kunnen worden gebruikt om virale replicatie te kwantificeren.
Sequentie-specifieke vernietiging van een eiwit of een nucleïnezuur geleid door een vreemde sequentie wordt alleen gezien in een paar gevallen in de biologie. De in Figuur 1 getoonde mechanismen zijn defensieve mechanismen die een host beschermen tegen een virus of een virus van een host.
Met behulp van bioinformatica methoden kunnen we de doelstellingen identificeren die door deze systemen worden vernietigd. In onze analyses van SSHHP-sequenties ontdekten we dat velen van hen gevonden konden worden in eiwitten die nodig waren om aangeboren immuunresponsen te genereren. Sommige hadden duidelijke rollen zoals Mavs en trif (TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β), terwijl andere waren gerelateerd aan immuniteit hoewel complexere mechanismen (bijv. histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. De doel informatie die is opgeslagen in de SSHHP-reeks heeft de potentie om trajecten te identificeren die antivirale effecten tegen deze virussen hebben. Antivirale reacties in vivo zijn vaak virus-specifieke26,43. Subsets van trim proteïnen hebben bijvoorbeeld antivirale effecten op verschillende virussen43,44,45, sommige zijn virale restrictie factoren (bijv. HIV en TRIM5α). De specificiteit van de trim eiwitten (~ 70 zijn geïdentificeerd) nog steeds wordt onderzocht44,45. De informatie binnen SSHHP’S kan bijdragen aan ons begrip van hoe deze virussen de aangeboren immuunresponsen omzeilen. Andere patronen en correlaties kunnen worden ontdekt naarmate meer SSHHP’S worden onderzocht.
In onze analyses zijn soortspecifieke verschillen zichtbaar (Figuur 2, Figuur 10). Het is bekend dat deze virussen sommige soorten meer beïnvloeden dan andere. Informatie over het hostbereik, de gevoeligheid van de host en de verdediging van de host kunnen aanwezig zijn in SSHHPS. Bijvoorbeeld, paarden, de meest vatbare soort voor paardachtigen encefalitis virussen, ontbrak de regio van de menselijke TRIM14 die transitief werd gesneden door de VEEV nsP2 protease. Mensen sterven zelden aan VEEV-infecties, maar kunnen24worden geïnfecteerd. De Human TRIM14 Protein droeg een nsP2 protease decolleté sequentie6. De aanwezigheid van de splijting site suggereren dat mensen hebben een afweermechanisme tegen deze virussen. Vogels zijn gedacht te zijn potentiële reservoirs van deze virussen46. De corresponderende SSHHP-sequentie in het TRIM14-eiwit van kippen verschaf van de sequenties gevonden bij mensen en andere soorten. Subtiele verschillen zoals deze kunnen een doelhost eiwit oncleavable of gemakkelijker gespleten maken. Aguirre et al.16 toonde aan dat een oncleavable gemuleerd snaar eiwit hogere niveaus van IFN veroorzaakte na infectie met het Denguevirus en dat muizen natuurlijk een versie van Sting dragen die niet door de dengue ns2B3 protease wordt gesneden. De Murine STING eiwit werd niet gesneden door de ZIKV protease47. In onze SSHHPS-analyse observeerden we ook verschillen in de sequenties van de ZIKV-protease-decolleté op de site toen we de menselijke eiwitten vergeleken met die van knaagdieren6 (Figuur 10D). Het reproduceren van de soortspecifieke Proteolytische splijting van gastheer eiwitten kan belangrijk zijn in diermodellen die worden gebruikt voor groep IV-virussen. De remming van host Protein decolleté heeft ook implicaties met betrekking tot de ontwikkeling van groep IV proteaseremmers. In onze vorige publicatie toonden we aan dat we TRIM14 decolleté konden remmen door de VEEV nsP2 protease met behulp van CA074 methyl ester6. Dit resultaat suggereert dat kleine molecuul remmers van deze proteasen in staat zijn om de aangeboren immuunresponsen te moduleren die de infectie kunnen onderdrukken6,31.
Genetische variatie binnen een soort heeft ook de potentie om verschillen in Proteolytische splijting te produceren. Subtiele verschillen in het gebruik van codon kunnen invloed hebben op ribosoom onderbreken van48. Omdat sommige groep IV virale proteasen zijn ingebed in het ER membraan, verschillen in deze pauzes kunnen invloed hebben op decolleté van een doelwit als decolleté co-translationally optreedt. Sommige van de decolleté sites die we identificeerden waren in voorspelde signaal peptide sequenties (bijv., SFRP1) terwijl anderen intern waren.
SSHHPS-analyse kan informatie produceren die verschilt van andere methoden voor het hosten van eiwit analyses. SSHHPS-analyse was goedkoop en eenvoudig in gebruik. Het gebruik van een bacteriële expressie systeem toegestaan het testen van korte segmenten (~ 25 aminozuren) van zoogdier sequenties zonder het gebruik van zoogdier celcultuur. We constateerden dat de GVB-YFP-substraten alle geteste menselijke eiwit sequenties konden tolereren; echter, de rendementen varieerden. In vergelijkbare assays, substraten met menselijke eiwit sequenties zolang 63 aminozuren werden met succes uitgedrukt, gezuiverd, en gebruikt voor kinetische analyses en remmer screening49,50,51. Aangezien slechts kleine hoeveelheden van het substraat nodig zijn voor de discontinue Assay, kan een groot aantal doelwitten worden verkend. Een voordeel van het systeem is dat de CFP/YFP-substraten kunnen worden gebruikt voor SDS-PAGE-analyses en voor uitgebreidere kinetische analyses (d.w.z. IC50, ki, km, VMax). Voor de opsporing van geneesmiddelen, remmende verbindingen kunnen produceren artefacten in fluorescerende assays. Zo kan de discontinue assay in combinatie met een continue test een decolleté of remming van decolleté bevestigen. De monsters voor de discontinue SDS-PAGE assay kunnen direct uit de 96-well platen worden genomen. CFP/YFP substraten zijn gebruikt voor samengestelde bibliotheek screening52. Er zijn echter aanvullende analyses nodig om te bepalen of een substraat geschikt is voor screening met een hoge doorvoer, zoals de berekening van een Z-factor53.
Een uitdaging bij het ontwerpen van een substraat is het identificeren van de regio rond de scissile binding die is gebonden en herkend door de protease. In de hier getoonde voorbeelden begonnen we met 12 residu sequenties die gecentreerd waren rond de scissile binding. Na het analyseren van sequentie overeenstemmingen van de decolleté sites werd homologie op de residuen N-terminal van de scissile binding gevonden voor de VEEV protease, terwijl voor de ZIKV protease homologie aan verschillende van de C-terminale residuen werd aangetroffen. Een in silico-model van het gedockte substraat kan worden gebruikt voor het ontwerpen van door de site geleide mutagenese experimenten die de bindingsplaatsen van het substraat sonde. Aangezien de substraat-en enzym sequenties op plasmiden staan, kan worden gemuleerd om de in silico-modellen of subsite toleranties te testen. Dit kan voordelig zijn als er geen kristalstructuur van het gebonden substraat (s) beschikbaar is.
SSHHPS-analyse kan ook nieuwe informatie opleveren over de mechanismen waarmee door virussen geïnduceerde fenotypes worden geproduceerd door virale enzymen. Een van de zikv targets, SFRP1, maakt deel uit van de Wnt signalering traject en heeft rollen in zowel hersenen en oog ontwikkeling en in de immuunresponsen36,37,54,55,56,57. We constateerden dat de andere eiwit sequenties die door de ZIKV ns2B/ns3 protease konden worden gesneden ook in eiwitten waren die betrokken waren bij de ontwikkeling van hersenen en ogen; afwijkingen in beide zijn waargenomen bij congenitale Zika syndroom en worden verondersteld deel uit te maken van het virus-geïnduceerde fenotype58.
De voorspelbaarheid van gastheer-pathogen interacties kunnen worden misbruikt voor een verscheidenheid van toepassingen: target-specifieke oncolytic virale therapieën; het-riskeren van levende virusvaccins; verfijning, voorspellen of selecteren van diermodellen; voorspelling van het hostbereik of de gevoeligheid; voorspelling van zoönotische gebeurtenissen; en voorspelling van de host-verdediging. Aangezien de beschreven methoden op volgorde gebaseerd zijn, kunnen ze van waarde zijn om in de toekomst in software te integreren.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Defense Threat reductie Agency (DTRA) projectnummers CB-SEED-SEED09-2-0061 en CBCall4-CBM-05-2-0019, en deels door de Intramural/Extramural onderzoeksprogramma van de NCATS, NIH (XH) en Naval Research Laboratory basis fondsen.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |