Vi presenterer en generell protokoll for å identifisere korte strekninger av homologe vert-patogen protein sekvenser (SSHHPS) innebygd i viral polyprotein. SSHHPS er anerkjent av viral proteaser og direkte målrettet ødeleggelse av bestemte vert proteiner av flere gruppe IV virus.
Alphaviral enzymer er syntetisert i en enkelt polypeptid. Den nonstructural polyprotein (nsP) er behandlet av sin nsP2 cystein protease å produsere aktive enzymer avgjørende for viral replikering. Viral proteaser er svært spesifikke og anerkjenne bevart kløft nettsted motiv sekvenser (~ 6-8 aminosyrer). I flere gruppe IV virus, den nsP protease (s) kløft nettstedet motiv sekvenser kan finnes i bestemte vert proteiner involvert i å generere medfødt immunresponser og, i noen tilfeller, målrettede proteiner synes å være knyttet til virus-indusert fenotype. Disse virusene utnytte korte strekninger av homologe vert-patogen protein sekvenser (SSHHPS) for målrettet ødeleggelse av verten proteiner. For å identifisere SSHHPS viral protease kløft nettstedet motiv sekvenser kan angitt inn BLAST og verten Genova (e) kan søkes. Kløft utgangspunktet kan testes ved hjelp av renset nsP viral protease og fluorescens resonans energi overføring (SLITE) underlag laget i E. coli. BÅND underlaget inneholder cyan og gult fluorescerende protein og kløft området sekvensen (CFP-Sequence-YFP). Denne protease analysen kan brukes kontinuerlig i en plate leser eller discontinuously i SDS-PAGE gels. Modeller av bundet peptid underlag kan genereres i silisiummangan å veilede substrat utvalg og mutagenese studier. CFP/YFP underlag har også blitt benyttet for å identifisere protease hemmere. Disse in vitro og i silisiummangan metoder kan brukes i kombinasjon med celle-baserte analyser for å avgjøre om målrettede vert protein påvirker viral replikering.
Bevis for horisontal genoverføring fra virus til vert, eller vertskap for virus, finnes i en rekke genomer1,2,3,4. Eksempler på viral endogenization er CRISPR spacer sekvenser funnet i bakteriell vert genomer4. I den seneste tid, vi har grunnlegge bevis av vert protein sekvenser lagt ned i inne det nonstructural polyproteins av (+) ssRNA gruppe IV viruser. Disse sekvensene innenfor koding regioner av viral Genova kan spres generationally. Den korte strekninger av homologe Host-patogen protein sekvenser (SSHHPS) er funnet i viruset og Host5,6. SSHHPS er den bevarte kløften området motiv sekvenser anerkjent av viral proteaser som har homologi til bestemte vert proteiner. Disse sekvensene direkte ødeleggelsen av bestemte vert proteiner.
I vår forrige utgivelse6, vi samlet en liste over alle de vert proteiner som ble målrettet av viral proteaser og fant at listen over mål var ikke tilfeldig (tabell 1). To trender var åpenbare. For det første, flertallet av viral proteaser det kutt vert protein tilhørte gruppe IV viruser (24 av 25 sakene involvert gruppe IV viral proteaser), og ettall protease tilhøre å det (+) ssRNA gruppe VI retroviruses (HIV, Human immunsviktvirus)7. For det andre, verten protein mål blir kuttet av viral proteaser var generelt involvert i å generere medfødte immunresponser antyder at splittelsene var ment å antagonize vertens immunresponser. Halvparten av verten proteiner målrettet av viral proteaser var kjent komponenter av signalering kaskader som genererer interferon (IFN) og proinflammatoriske cytokiner (tabell 1). Andre var involvert i Host Cell transkripsjon8,9,10 eller oversettelse11. Interessant, Shmakov et al.4 har vist at mange CRISPR protospacer sekvenser tilsvarer gener involvert i plasmider Bøyning eller replikering4.
Gruppe IV omfatter blant annet hvilken, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae og Togaviridae. Flere nye og framvoksende patogener tilhører gruppe IV som Zika-viruset (ZIKV), West Nile (WNV), Chikungunya (CHIKV), alvorlig akutt respiratorisk syndrom virus (SARS) og Midtøsten respiratorisk syndrom virus (MERS). Det (+) ssRNA Genova er i all vesentlighet en stykke mRNA. Å tilvirke det enzym på krevd for Genova replikering, det (+) ssRNA Genova for det første må være oversatt. I alphaviruses og andre gruppe IV-virus produseres enzymene som er nødvendige for replikering i en enkelt polyprotein (dvs. nsP1234 for VEEV). Nonstructural polyprotein (nsP) er proteolytically behandlet (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) av nsP2-protease for å produsere aktive enzymer12 (figur 1). Kløft av polyprotein av nsP2 protease er avgjørende for viral replikering; Dette har blitt demonstrert ved sletting og site-regissert mutagenese av det aktive nettstedet cystein av nsP2 protease13,14. Spesielt, oversettelsen av viral proteiner foran Genova replikering hendelser. NsP4 inneholder for eksempel den RNA-avhengige RNA-polymerase som trengs for å replikere (+) ssRNA-Genova. Genova replikering kan produsere dsRNA mellom produkter; disse mellom produkter kan utløse vertens medfødte immunresponser. Dermed kan disse virusene holde vert medfødt immunrespons proteiner tidlig i smitte for å undertrykke sine effekter15,16,17.
Å stanse kan forekomme på DNA-, RNA-og protein nivået. Det som er felles for hver av mekanismene for deaktivering som vises i figur 1 , er at korte, utenlandske DNA-, RNA-eller protein sekvenser brukes til å lede ødeleggelsen av bestemte mål for å antagonize deres funksjon. Mekanismene for demping er analoge til «søk og slett»-programmer som er skrevet på tre forskjellige språk. Den korte kløften området sekvensen er analogt til et “søkeord”. Hvert program har et enzym som anerkjenner kampen mellom den korte sekvensen (“søkeordet”) og et ord i “fil” som skal slettes. Når en kamp blir funnet, enzymet kutt (“sletter”) den større mål sekvensen. De tre mekanismene som vises i figur 1 brukes til å forsvare verten mot virus, eller til å forsvare et virus fra en vertens immunsystem.
Viral proteaser anerkjenner kort kløft nettsted motiv sekvenser mellom ~ 2-11 aminosyrer; i nukleotider, ville dette tilsvare 6-33 baser. Til sammenligning er CRISPR spacer sekvenser ~ 26-72 nukleotider og RNAi er ~ 20-22 nukleotider18,19. Selv om disse sekvensene er relativt korte, kan de bli gjenkjent spesifikt. Gitt høyere mangfold av aminosyrer, sannsynligheten for en tilfeldig kløft hendelse er relativt lav for en viral protease gjenkjenne protein sekvenser av 6-8 aminosyrer eller lengre. Prediksjon av SSHHPS i vert proteiner vil i stor grad avhenge av spesifisitet av viral protease blir undersøkt. Hvis protease har strenge sekvens spesifisitet krav muligheten til å finne en kløft området sekvensen er 1/206 = 1 i 64 000 000 eller 1/208 = 1 i 25 600 000 000; imidlertid har de fleste proteaser variable toleranser (f.eks. R eller K kan tolereres på S1-nettstedet). Følgelig er det ingen krav til sekvens identitet mellom sekvensene funnet i verten versus viruset. For viral proteaser som har løsere sekvens krav (for eksempel de som tilhører Picornaviridae) sannsynligheten for å finne en kløft sted i en vert protein kan være høyere. Mange av oppføringene i tabell 1 er fra Picornaviridae -familien.
Schechter & Berger-notasjon20 brukes vanligvis til å beskrive restene i et protease substrat og de sekundære områdene som de binder, vi bruker denne notasjonen gjennom. Rester i underlaget som er N-Terminal av scissile Bond er betegnet som P3-P2-P1 mens de som er C-terminal er betegnet som P1′-P2′-P3 ‘. De tilsvarende sekundære områdene i protease som binder disse aminosyre-restene, er henholdsvis S3-S2-S1 og S1′-S2’-S3.
For å finne ut hvilken vert proteiner blir målrettet, kan vi identifisere SSHHPS i viral polyprotein kløften områder og søke etter verten proteiner som inneholder dem. Heri, skisserer vi prosedyrer for å identifisere SSHHPS bruke kjente viral protease kløft site sekvenser. De Bioinformatic metodene, protease analysene og silisiummangan metodene som er beskrevet, er ment å brukes sammen med cellebasert analyser.
Sekvens justering av verten proteiner målrettet av viral proteaser har avdekket arter-spesifikke forskjeller innenfor disse korte kløft området sekvenser. For eksempel, den venezuelanske Equine Encefalitt virus (VEEV) nsP2 protease ble funnet å kutte menneskelige TRIM14, en tre parts motiv (TRIM) protein6. Noen TRIM proteiner er viral begrensning faktorer (f. eks TRIM5α21), de fleste antas å være ubiquitin E3 ligases. TRIM14 mangler en RING (veldig interessant nytt gen) domene og er ikke antatt å være en E3 ligase22. TRIM14 har blitt foreslått å være en adapter i mitokondrie antiviral signalosome (MAVS)22, men kan ha andre antivirale funksjoner23. Justering av TRIM14 sekvenser fra ulike arter viser at equine mangler kløften området og havnen en avkortet versjon av TRIM14 som mangler C-terminal SNUSE/SPRY domene. Dette domenet inneholder et polyubiquitination område (figur 2). I equine, disse virusene er svært dødelige (~ 20-80% dødelighet), mens i mennesker bare ~ 1% dør av VEEV infeksjoner24. Kløft av det SNUSE/SPRY domenen kanskje midlertidig kort kretsløpet det MAVS signal Cascade. Dette Cascade kan utløses av dsRNA og fører til produksjon av interferon og Pro-inflammatorisk cytokiner. Dermed kan tilstedeværelsen av SSHHPS være nyttig for å forutsi hvilke arter som har forsvarssystemer mot bestemte gruppe IV virus.
I gruppe IV virus, IFN motsetningen mekanismer antas å være multiplisere redundant25. Vert protein kløft kan være forbigående under smitte og konsentrasjoner kan komme seg over tid. Vi fant i celler som TRIM14 kløft produkter kunne oppdages svært tidlig etter transfeksjoner (6 h) med en plasmider koding av protease (Cytomegalovirus promoter). Men i lengre perioder ble ikke kløft-produktene oppdaget. I virus-infiserte celler, Kinetics var forskjellige og kløft produkter kunne oppdages mellom 6-48 h6. Andre har rapportert utseendet på Host protein kløft produkter så tidlig som 3-6 h post infeksjon9,11.
Proteolytiske aktivitet i cellene er ofte vanskelig å fange; mat fra kløften kan variere i løselighet, konsentrasjon, stabilitet og levetid. I celle-baserte analyser det kan ikke antas at kløft produkter vil akkumuleres i en celle eller at bandet intensitet av kutt og Uncut protein vil vise kompenserende øker og avtar som kutt protein kan bli degradert svært raskt og kan ikke være synlig i en vestlig blot på en forventet molekylvekt (MW) (f. eks regionen inneholder epitope kunne kløyvde av andre vert proteaser eller kan være ubiquitinated). Hvis underlaget av viral protease er en medfødt immunrespons protein, konsentrasjonen kan variere under infeksjon. For eksempel, noen medfødt immunrespons proteiner er til stede før viral infeksjon og er indusert ytterligere ved interferon26. Konsentrasjonen av målet protein kan derfor svinge under infeksjon og sammenligning av infisert vs infisert celle lysater kan være vanskelig å tolke. I tillegg kan alle celler ikke være jevnt transfekterte eller infisert. In vitro protease analyser ved hjelp av renset proteiner fra E. coli på den annen side har færre variabler som å kontrollere og slike analyser kan gjøres ved hjelp av SDS-side i stedet for immunoblots. Forurensende proteaser kan bli hemmet i de tidlige trinnene av protein rensing av CFP/YFP substrat, og mutert viral proteaser kan renses og testes som kontroller for å avgjøre om kløften skyldes viral protease eller en forurensende bakteriell protease.
En begrensning av in vitro protease analyser er at de mangler kompleksiteten av en pattedyr celle. For et enzym for å kutte sitt substrat, må de to være co-lokaliserte. Gruppe IV viral proteaser varierer i struktur og lokalisering. For eksempel er ZIKV-protease innebygd i endoplasmatiske retikulum (ER)-membranen og vender mot stoffer, mens VEEV nsP2-protease er et løselig protein i cytoplasma og nucleus27. Noen av kløften området sekvenser funnet i ZIKV SSHHPS analysen var i signal peptider antyder at kløften kan oppstå co-translationally for noen mål. Dermed må plasseringen av protease og underlaget i cellen også vurderes i disse analysene.
Celle-baserte analyser kan være verdifulle for å etablere en rolle for identifiserte verts protein (er) i infeksjon. Metoder som tar sikte på å stanse viral protease kløft av verten proteiner som tillegg av en protease inhibitor6 eller en mutasjon i verten målet16 kan brukes til å undersøke deres effekter på viral replikering. Overuttrykte av det målrettede proteinet kan også påvirke viral replikering28. Plakk analyser eller andre metoder kan brukes til å kvantifisere viral replikering.
Sekvens-spesifikk ødeleggelse av et protein eller en nukleinsyre syre guidet av en utenlandsk sekvens er bare sett i noen tilfeller i biologi. Mekanismene som vises i figur 1 er defensive mekanismer som beskytter en vert fra et virus, eller et virus fra en vert.
Bruke Bioinformatic metoder vi kan identifisere de målene som er ødelagt av disse systemene. I vår analyse av SSHHP sekvenser, oppdaget vi at mange av dem kunne finnes i proteiner som trengs for å generere medfødte immunresponser. Noen hadde åpenbare roller som Mavs og TRIF (tir-domene-som inneholder adapter-inducing interferon-β), mens andre var relatert til immunitet om mer komplekse mekanismer (f. eks histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Målet informasjon som er lagret i SSHHP sekvensen har potensial til å identifisere trasé som har antivirale effekter mot disse virusene. Antivirale responser i Vivo er ofte virus spesifikke26,43. For eksempel, delsett av trim proteiner har antivirale effekter på ulike virus43,44,45, noen er viral begrensning faktorer (f. eks, HIV og TRIM5α). Det spesielle ved trim proteiner (~ 70 har blitt identifisert) fortsatt blir undersøkt44,45. Informasjonen innen SSHHPS kan bidra til vår forståelse av hvordan disse virusene unngå medfødte immunresponser. Andre mønstre og sammenhenger kan bli avdekket som mer SSHHPS er undersøkt.
Det var tydelige forskjeller i arten i analysene våre (figur 2, Figur 10). Disse virusene er kjent for å påvirke noen arter mer enn andre. Informasjon om vertsområde, verts mottakelighet og verts beskyttelse kan være til stede i SSHHPS. For eksempel, equine, den mest mottakelige arter til Equine Encefalitt virus, manglet regionen menneskelige TRIM14 som ble midlertidig kuttet av VEEV nsP2 protease. Mennesker sjelden dør av VEEV infeksjoner, men kan være infisert24. Den menneskelige TRIM14 protein gjennomført en nsP2 protease kløft sekvens6. Tilstedeværelsen av kløft stedet tyder på at mennesker har en forsvarsmekanisme mot disse virusene. Fugler har vært antatt å være potensielle reservoarer av disse virusene46. Den tilsvarende SSHHP sekvensen i TRIM14 protein fra kyllinger forskjellig fra sekvenser som finnes i mennesker og andre arter. Subtile forskjeller som dette kan gjøre en mål vert protein uncleavable eller lettere kløyvde. Aguirre et al.16 viste at en UNCLEAVABLE mutert streng protein indusert høyere nivåer av IFN etter Dengue virus infeksjon og at mus naturlig bære en versjon av STING som ikke er kuttet av Dengue ns2B3 protease. Det murine STING proteinet ble ikke kuttet av ZIKV protease47. I vår SSHHPS analyse observerte vi også forskjeller i ZIKV protease kløft side sekvenser når vi sammenlignet de menneskelige proteinene med de av gnagere6 (Figur 10D). Gjengivelse av arter-spesifikke proteolytiske splittelsene av verten proteiner kan være viktig i dyremodeller som brukes for gruppe IV virus. Den hemming av verten protein kløften har også implikasjoner med hensyn til utvikling av gruppe IV protease hemmere. I vår forrige utgivelse, viste vi at vi kunne hemme TRIM14 kløft av VEEV nsP2 protease bruker CA074 methyl ester6. Dette resultatet tyder på at små molekyl hemmere av disse proteaser kan være i stand til å modulere de medfødte immunresponser som er i stand til å undertrykke infeksjonen6,31.
Genetisk variasjon i en Art har også potensiale til å produsere forskjeller i proteolytiske kløft. Subtile forskjeller i Codon bruk kan påvirke ribosom pause48. Siden noen gruppe IV virale proteaser er innebygd i ER-membranen, kan forskjellene i disse pauser påvirke kløften av et mål hvis kløften oppstår translationally. Noen av kløften områder som vi identifiserte var i spådd signal peptid sekvenser (f. eks SFRP1) mens andre var interne.
SSHHPS analyse kan produsere informasjon som avviker fra andre metoder for vert protein analyser. SSHHPS analyse var billig og enkel å ansette. Bruken av et bakteriell uttrykks system tillot testing av korte segmenter (~ 25 aminosyrer) av pattedyr sekvenser uten bruk av pattedyr cellekultur. Vi fant at CFP-YFP underlag var i stand til å tolerere alle de testede menneskelige protein sekvenser; imidlertid gir varierte. I lignende analyser, underlag som inneholder menneskelige protein sekvenser så lenge som 63 aminosyrer ble vellykket uttrykt, renset, og benyttet for kinetisk analyser og hemmer screening49,50,51. Siden bare små mengder av underlaget er nødvendig for usammenhengende analysen, kan et stort antall mål utforskes. En fordel med systemet er at CFP/YFP underlag kan brukes til SDS-side analyser og for mer forseggjort kinetisk analyser (dvs. IC50, ki, km, VMax). For narkotika oppdagelse kan hemmende stoffer produsere artefakter i fluorescerende analyser. Således, den usammenhengende analysen i kombinasjon med en kontinuerlig analysen tillater en å bekrefte kløft eller hemming av kløft. Prøvene for den usammenhengende SDS-PAGE-analysen kan tas direkte ut av 96-brønn platene. CFP/YFP underlag har blitt brukt til sammensatte biblioteket screening52. Det er imidlertid nødvendig med flere analyser for å avgjøre om et substrat er egnet for screening med høy gjennomstrømning, for eksempel beregning av en Z-faktor53.
En utfordring i å designe et substrat er å identifisere regionen rundt scissile bånd som er bundet og anerkjent av protease. I eksemplene som vises her, begynte vi med 12 rester sekvenser som var sentrert rundt scissile obligasjon. Etter å ha analysert sekvens justering av kløften nettsteder homologi til rester N-Terminal av scissile bindingen ble funnet for VEEV protease, mens for ZIKV protease homologi til flere av C-terminalen rester ble funnet. En i silisiummangan modell av forankret underlaget kan brukes til å designe site-regissert mutagenese eksperimenter som sonde bindingen områder av underlaget. Siden underlaget og enzymet sekvenser er på plasmider, enten kan være mutert til å teste i silisiummangan modeller eller sekundært område toleranser. Dette kan være en fordel hvis en krystallstruktur av bundet substrat (er) ikke er tilgjengelig.
SSHHPS analyse kan også gi ny informasjon om de mekanismer som virus-indusert fenotyper er produsert av viral enzymer. En av de ZIKV mål, SFRP1, er en del av wnt signalering Pathway og har roller i både hjerne og øye utvikling og i immunresponser36,37,54,55,56,57. Vi fant at de andre protein sekvenser som kunne kuttes av ZIKV ns2B/ns3 protease var også i proteiner involvert i hjerne-og øye utvikling; unormalt i begge har blitt observert i medfødt Zika syndrom og antas å være en del av viruset-indusert fenotype58.
Den forutsigbarhet av verts-patogen interaksjoner kan utnyttes for en rekke bruksområder: Target-spesifikke oncolytic viral terapi; de-risikere levende virusvaksiner; raffinement, prediksjon eller valg av dyremodeller; prediksjon av Host-Range eller mottakelighet; prediksjon av zoonotiske hendelser; og prediksjon av Host-forsvar. Siden metodene som beskrives er sekvens BAS ert, kan de være av verdi å innlemme i programvare i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Defense Threat Reduction Agency (DTRA) prosjektnumre CB-SEED-SEED09-2-0061 og CBCall4-CBM-05-2-0019, og delvis av intramural/ekstra forskningsprogram av NCATS, NIH (XH) og Naval Research Laboratory base fond.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |