Vi presenterar ett allmänt protokoll för att identifiera korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (SSHHPS) inbäddade i viral polyprotein. SSHHPS erkänns av virala proteaser och rikta den riktade förstörelsen av specifika värd proteiner av flera grupp IV virus.
Alphaviral enzymer syntetiseras i en enda polypeptid. Den icke-strukturella polyprotein (nsP) bearbetas av dess nsP2 cystein proteashämmare att producera aktiva enzymer som är viktiga för viral replikering. Viral proteaser är mycket specifika och erkänna bevaras klyvning webbplats motiv sekvenser (~ 6-8 aminosyror). I flera grupp IV-virus, kan nsP protease (s) klyvning webbplats motiv sekvenser hittas i specifika värd proteiner som är involverade i att generera det medfödda immunsvaret och, i vissa fall, de riktade proteinerna verkar vara kopplade till den virusinducerade fenotypen. Dessa virus utnyttjar korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (SSHHPS) för riktad förstörelse av värd proteiner. För att identifiera SSHHPS kan virus proteas klyvning av platssekvenserna matas in i BLAST och värd genomet (s) kan sökas. Klyvning initialt kan testas med hjälp av renad NSP viral proteas och fluorescens resonans energiöverföring (FRET) substrat gjorda i E. coli. BANDET substrat innehåller cyan och gult fluorescerande protein och klyvning webbplatssekvens (CFP-sekvens-YFP). Denna proteasanalys kan användas kontinuerligt i en Plattläsare eller inte kontinuerligt på SDS-PAGE Gels. Modeller av de bundna peptid substrat kan genereras i silico för att vägleda substrat urval och mutagenes studier. CFP/YFP-substrat har också utnyttjats för att identifiera proteashämmare. Dessa in vitro-och silico-metoder kan användas i kombination med cellbaserade analyser för att avgöra om det riktade värd proteinet påverkar virusreplikation.
Bevis på horisontell genöverföring från virus till värd, eller värd för virus, kan hittas i en mängd av genomen hos1,2,3,4. Exempel på viral endogenisering är CRISPR-distanserna som finns i bakteriernas värd-genomen hos4. Nyligen har vi funnit bevis på värd proteinsekvenser inbäddade i icke-strukturella polyproteiner av (+) ssRNA grupp IV virus. Dessa sekvenser inom kodnings regionerna i viral genomet kan spridas generationellt. Den korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (sshhps) finns i viruset och värd5,6. SSHHPS är den bevarade klyvning webbplats motiv sekvenser erkänns av virala proteaser som har homologi till specifika värd proteiner. Dessa sekvenser direkt förstörelsen av specifika värd proteiner.
I vår tidigare publikation6, vi sammanställt en lista över alla de värden proteiner som var riktade av virala proteaser och fann att listan över mål var icke-slumpmässigt (tabell 1). Två trender var uppenbara. Först, majoriteten av de virala proteaser som skär värd proteiner tillhörde grupp IV virus (24 av 25 fall inblandade grupp IV virala proteaser), och en proteas tillhörde (+) ssRNA grupp VI retrovirus (HIV, humant immunbristvirus)7. För det andra var värd protein mål som skärs av virala proteaser i allmänhet inblandade i att generera den medfödda immunsvar tyder på att klyvning var avsedda att motverka värdens immunsvar. Hälften av de värden proteiner riktade av virala proteaser var kända komponenter av signalering kaskader som genererar interferon (IFN) och proinflammatoriska cytokiner (tabell 1). Andra var inblandade i värdcelltranskription8,9,10 eller Translation11. Intressant, SHmakov et al.4 har visat att många CRISPR protospacer sekvenser motsvarar gener inblandade i plasmid konjugering eller replikering4.
Grupp IV omfattar bland annat Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae och togaviridae. Flera nya och framväxande patogener tillhör grupp IV såsom zika virus (ZIKV), West Nile (WNV), chikungunya (CHIKV), svår akut respiratorisk syndrom virus (SARS) och Mellanöstern respiratoriskt syndrom virus (MERS). Den (+) ssRNA arvsmassan är i huvudsak en bit av mRNA. För att producera de enzymer som krävs för genomreplikering måste (+) ssRNA-genomet först översättas. I alphaviruses och andra grupp IV virus, de enzymer som krävs för replikering produceras i en enda polyprotein (dvs., nsP1234 för VEEV). Den icke-strukturella polyprotein (nsP) är proteolytically bearbetas (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) av nsP2 proteas att producera aktiva enzymer12 (figur 1). Klyvning av polyprotein av nsP2 proteas är viktigt för viral replikering; Detta har visats genom radering och platsriktade mutagenes av den aktiva webbplatsen cystein av nsP2 proteas13,14. I synnerhet, översättningen av virala proteiner föregår genomreplikering händelser. Till exempel innehåller nsP4 RNA-beroende RNA-polymeras som behövs för att replikera (+) ssRNA-genomet. Genomreplikering kan producera dsRNA-intermediärer. dessa intermediärer kan utlösa värdens medfödda immunsvar. Sålunda, dessa virus kan klyva värd medfödda immunsvar proteiner tidigt i infektionen för att undertrycka deras effekter15,16,17.
Ljuddämpning kan förekomma på DNA-, RNA-och proteinnivå. Vad som är gemensamt för var och en av de ljuddämpnings metoder som visas i figur 1 är att korta främmande DNA-, RNA-eller proteinsekvenser används för att vägleda förstörelsen av specifika mål för att motverka deras funktion. Ljuddämpnings mekanismerna är analoga med “Sök och ta bort”-program som har skrivits på tre olika språk. Den korta klyvning webbplats sekvens är jämförbar med ett “nyckelord”. Varje program har ett enzym som erkänner matchen mellan den korta sekvensen (“sökordet”) och ett ord i “filen” som ska raderas. När en match hittas, minskar enzymet (“raderar”) den större målsekvensen. De tre mekanismerna som visas i figur 1 används för att försvara värden från virus, eller för att försvara ett virus från värdens immunförsvar.
Virala proteaser erkänna korta klyvning webbplats motiv sekvenser mellan ~ 2-11 aminosyror; i nucleotides, skulle detta motsvara till 6-33 baser. För jämförelse är CRISPR spacer sekvenser ~ 26-72 nukleotider och RNAi är ~ 20-22 nukleotider18,19. Även om dessa sekvenser är relativt korta, kan de kännas igen specifikt. Med tanke på den högre mångfalden av aminosyror, sannolikheten för en slumpmässig klyvning händelse är relativt låg för en viral proteas erkänner proteinsekvenser av 6-8 aminosyror eller längre. Prediktion av SSHHPS i värd proteiner kommer till stor del bero på specificiteten hos viral proteas undersöks. Om proteasen har strikta sekvens specificitet krav chansen att hitta en klyvning webbplats sekvens är 1/206 = 1 i 64 000 000 eller 1/208 = 1 i 25 600 000 000; de flesta proteaser har dock variabla toleranser för underwebbplatsen (t. ex. kan R eller K tolereras på S1-platsen). Därför finns det inget krav för sekvens identitet mellan sekvenser som finns i värden kontra viruset. För virala proteaser som har lösare sekvenskrav (t. ex. de som tillhör Picornaviridae) kan sannolikheten för att hitta en klyvning plats i ett värd protein vara högre. Många av posterna i tabell 1 är från familjen Picornaviridae .
Schechter & Berger notation20 används ofta för att beskriva resterna i ett proteassubstrat och de underwebbplatser som de binder, vi använder denna notation hela. Resterna i substratet som är N-terminalen på scissile Bond betecknas som P3-P2-P1 medan de som är C-Terminal betecknas som P1′-P2′-P3 “. Motsvarande underwebbplatser i proteasen som binder dessa aminosyrerester är S3-S2-S1 och S1′-S2′-S3 respektive.
För att avgöra vilka värden proteiner som riktas, kan vi identifiera SSHHPS i viral polyprotein klyvning platser och söka efter de värden proteiner som innehåller dem. Häri beskriver vi procedurer för att identifiera SSHHPS med hjälp av kända viral proteas klyvning webbplats sekvenser. De bioinformatiska metoderna, proteasanalyserna och de beskrivna silico-metoderna är avsedda att användas tillsammans med cellbaserade analyser.
Sekvensanpassningar av värden proteiner riktade av virala proteaser har avslöjat artspecifika skillnader inom dessa korta klyvning webbplatssekvens. Till exempel konstaterades att det venezuelanska Equine encefalit-viruset (VEEV) nsP2 proteashämmare var att skära humant TRIM14, ett treparts motiv (TRIM) protein6. Vissa TRIMPROTEINER är virala begränsnings faktorer (t. ex. TRIM5α21), de flesta tros vara ubiquitin E3 Ligaser. TRIM14 saknar en RING (riktigt intressant ny gen) domän och är inte tänkt att vara en E3 Ligase22. TRIM14 har föreslagits vara en adapter i mitokondrie antiviral signalosome (MAVS)22, men kan ha andra antivirala funktioner23. Anpassning av TRIM14 sekvenser från olika arter visar att Equine saknar klyvning plats och hamn en stympad version av TRIM14 som saknar C-terminalen PRY/SPRY domän. Denna domän innehåller en polvubiquitinering webbplats (figur 2). I Equine, dessa virus är mycket dödliga (~ 20-80% dödlighet) medan hos människor endast ~ 1% dör från VEEV infektioner24. Klyvning av PRY/SPRY-domänen kan transitivt kortslutning MAVS signalering kaskad. Denna kaskad kan utlösas av dsRNA och leder till produktion av interferon och pro-inflammatoriska cytokiner. Således kan närvaron av SSHHPS vara användbart för att förutsäga vilka arter har försvarssystem mot specifika grupp IV virus.
I grupp IV-virus tros IFN-antagonism-mekanismer multiplicera överflödig25. Host protein klyvning kan vara övergående under infektion och koncentrationer kan återhämta sig med tiden. Vi hittade i celler som TRIM14 klyvning produkter kan upptäckas mycket tidigt efter transfektion (6 h) med en Plasmid kodning proteasen (cytomegalovirus promotor). Vid längre perioder upptäcktes dock inte klyvning produkter. I virusinfekterade celler var kinetikerna olika och klyvning produkter kunde upptäckas mellan 6-48 h6. Andra har rapporterat uppkomsten av Host protein klyvning produkter så tidigt som 3-6 h post infektion9,11.
Proteolytisk aktivitet i celler är ofta svårt att fånga; klyvning produkter kan variera i deras löslighet, koncentration, stabilitet, och livslängd. I cellbaserade analyser kan man inte utgå från att klyvbara produkter ackumuleras i en cell eller att bandintensiteten i snitt och oklippt protein kommer att Visa kompenserande ökningar och minskningar eftersom det skurna proteinet kan brytas ned mycket snabbt och inte kan upptäckas i en västerländsk blot vid en förväntad molekylvikt (MW) (t. ex. den region som innehåller epitopen kan klyvas av andra värd proteaser eller kan vara ubiquitinated). Om substrat för viral proteas är ett medfödda immunsvar protein, dess koncentration kan variera under infektion. Till exempel, vissa medfödda immunsvar proteiner är närvarande före virusinfektion och induceras ytterligare av interferon26. Koncentrationen av målproteinet kan därför fluktuera under infektion och jämförelse av icke-infekterade vs. infekterade celllysat kan vara svåra att tolka. Dessutom, alla celler kan inte vara enhetligt transfekterade eller infekterade. In vitro-proteasanalyser med renade proteiner från E. coli å andra sidan har färre variabler för vilka man kan kontrollera och sådana analyser går att göra med SDS-Page snarare än Immunoblots. Kontaminerande proteaser kan hämmas i de tidiga stegen av Proteinrening av den gemensamma fiskeripolitiken/YFP-substrat, och muterade virala proteaser kan renas och testas som kontroller för att avgöra om klyvning beror på viral proteas eller en förorenande bakteriell proteas.
En begränsning av in vitro-proteasanalyser är att de saknar komplexiteten hos en däggdjurscell. För ett enzym att skära dess substrat, de två måste vara co-lokaliserade. Grupp IV viral proteaser skiljer sig åt i struktur och lokalisering. Till exempel är ZIKV proteashämmare inbäddad i endoplasmatiska Retikulum (ER) membranet och ansikten Cytosol, medan VEEV nsP2 proteashämmare är ett lösligt protein i cytoplasman och Nucleus27. Några av de klyvning webbplats sekvenser hittades i ZIKV SSHHPS analys var i signal peptider tyder på att klyvning kan förekomma samtranslationellt för vissa mål. Därför måste även placeringen av proteasen och underlaget i cellen övervägas i dessa analyser.
Cellbaserade analyser kan vara värdefulla för att fastställa en roll för de identifierade värd proteinet (-erna) vid infektion. Metoder som syftar till att stoppa viral proteas klyvning av värd proteiner såsom tillsats av en proteashämmare6 eller en mutation i värd mål16 kan användas för att undersöka deras effekter på viral replikering. Överuttryck av det riktade proteinet kan också påverka viral replikering28. Plack analyser eller andra metoder kan användas för att kvantifiera viral replikering.
Sekvens-specifik förstörelse av ett protein eller en nukleinsyra styrs av en utländsk sekvens ses endast i ett fåtal fall i biologi. Mekanismerna som visas i figur 1 är defensiva mekanismer som skyddar en värd från ett virus, eller ett virus från en värd.
Med hjälp av bioinformatiska metoder kan vi identifiera de mål som förstörs av dessa system. I våra analyser av SSHHP sekvenser upptäckte vi att många av dem kunde hittas i proteiner som behövs för att generera medfödda immunsvar. Vissa hade uppenbara roller som Mavs och TRIF (TIR-domän-innehållande adapter-inducerande interferon-β), medan andra var relaterade till immunitet men mer komplexa mekanismer (t. ex., histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Målinformationen som lagras i SSHHP-sekvensen har potential att identifiera vägar som har antivirala effekter mot dessa virus. Antivirala svar in vivo är ofta virusspecifika26,43. Till exempel, delmängder av trim proteiner har antiviral effekter på olika virus43,44,45, vissa är virus begränsning faktorer (t. ex., hiv och TRIM5α). Specificiteten hos trim proteiner (~ 70 har identifierats) fortfarande undersöks44,45. Informationen inom SSHHPS kan bidra till vår förståelse av hur dessa virus kringgå det medfödda immunsvaret. Andra mönster och korrelationer kan avslöjas som mer SSHHPS undersöks.
Artspecifika skillnader var uppenbara i våra analyser (figur 2, figur 10). Dessa virus är kända för att påverka vissa arter mer än andra. Information om värd omfång, värdmottaglighet och värd försvar kan förekomma inom SSHHPS. Till exempel, Equine, de mest mottagliga arter till Equine encefalit virus, saknade den region av Human TRIM14 som var transitivt skuren av VEEV nsP2 proteas. Människor dör sällan från VEEV infektioner men kan infekteras24. Human TRIM14 proteinet bar en nsP2 proteas klyvning sekvens6. Närvaron av klyvning webbplats tyder på att människor har en försvarsmekanism mot dessa virus. Fåglar har tros vara potentiella reservoarer av dessa virus46. Motsvarande SSHHP sekvens i TRIM14 protein från kycklingar skilde sig från de sekvenser som finns i människor och andra arter. Subtila skillnader som dessa kan göra ett mål värd protein uncleavable eller mer lätt klyvs. Aguirre et al.16 visade att en uncleavable MUTERAT String protein inducerade högre nivåer av IFN efter denguefeber infektion och att möss naturligtvis bära en version av STING som inte skärs av Dengue ns2B3 proteas. Det murina STING proteinet klipptes inte av ZIKV-proteasen47. I vår SSHHPS-analys observerade vi också skillnader i ZIKV proteashämmare-klyvningssekvenserna när vi jämförde människans proteiner med de hos gnagare6 (figur 10D). Reproduktion av artspecifika proteolytiska klyvning av värd proteiner kan vara viktigt i djurmodeller som används för grupp IV virus. Hämning av Host protein klyvning har också konsekvenser när det gäller utvecklingen av grupp IV proteashämmare. I vår tidigare publikation visade vi att vi kunde hämma TRIM14 klyvning av VEEV nsP2 proteas med CA074 metylester6. Detta resultat tyder på att små molekyler hämmare av dessa proteaser kan kunna modulera den medfödda immunsvar som kan undertrycka infektionen6,31.
Genetisk variation inom en art har också potential att producera skillnader i proteolytisk klyvning. Subtila skillnader i kodon användning kan påverka ribosom pausa48. Eftersom vissa grupp IV virala proteaser är inbäddade i ER-membranet, kan skillnader i dessa pauser påverka klyvning av ett mål om klyvning sker samtranslationellt. Några av de klyvning webbplatser som vi identifierade var i förväntad signal peptid sekvenser (t. ex., SFRP1) medan andra var interna.
SSHHPS analys kan producera information som skiljer sig från andra metoder för värd protein analyser. SSHHPS analys var billig och lätt att anställa. Användningen av ett bakteriellt uttrycks system tillät testning av korta segment (~ 25 aminosyror) av däggdjurs sekvenser utan användning av däggdjurscell kulturer. Vi konstaterade att den gemensamma fiskeripolitiken-YFP-substrat kunde tolerera alla testade humana proteinsekvenser; avkastningen varierade dock. I liknande analyser, substrat som innehåller mänskliga proteinsekvenser så länge som 63 aminosyror var framgångsrikt uttryckt, renas, och utnyttjas för kinetiska analyser och inhibitor screening49,50,51. Eftersom endast små mängder av substratet behövs för den diskontinuerliga analysen, kan ett stort antal mål utforskas. En fördel med systemet är att den gemensamma fiskeripolitiken/YFP-substrat kan användas för SDS-PAGE analyser och för mer avancerade kinetiska analyser (dvs. IC50, ki, km, VMax). För läkemedels upptäckt, inhibitoriska föreningar kan producera artefakter i fluorescerande analyser. Sålunda, den diskontinuerliga analysen i kombination med en kontinuerlig analys tillåter en att bekräfta klyvning eller hämning av klyvning. Proverna för den diskontinuerliga SDS-PAGE-analysen kan tas direkt ur plattorna 96-well. CFP/YFP-substrat har använts för sammansatt biblioteks screening52. Emellertid, ytterligare analyser krävs för att avgöra om ett substrat är lämplig för hög genomströmning screening såsom beräkning av en Z-faktor53.
En utmaning i utformningen av ett substrat är att identifiera regionen runt scissile Bond som är bunden och erkänd av proteasen. I exemplen som visas här, började vi med 12 rester sekvenser som var centrerad kring scissile Bond. Efter att ha analyserat sekvens anpassningar av klyvning platser homologi till rester N-terminalen av scissile Bond hittades för Veev proteashämmare, medan för zikv proteashämmare homologi till flera av C-terminalen rester hittades. En in silico modell av det dockade underlaget kan användas för att utforma platsriktade mutagenes experiment som sond bindningsställen av underlaget. Eftersom substrat och enzymsekvenser är på plasmider, antingen kan muteras för att testa i silico modeller eller under plats toleranser. Detta kan vara fördelaktigt om en kristallstruktur av det bundna underlaget (s) inte är tillgänglig.
SSHHPS analys kan också ge ny information om de mekanismer genom vilka virusinducerade fenotyper produceras av virala enzymer. En av de zikv mål, SFRP1, är en del av WNT signalvägen och har roller i både hjärna och ögon utveckling och i immunsvar36,37,54,55,56,57. Vi fann att de andra proteinsekvenser som skulle kunna skäras av ZIKV ns2B/NS3 proteashämmare var också i proteiner inblandade i hjärnans och ögats utveckling; avvikelser i båda har observerats i medfött zika syndrom och tros vara en del av den virusinducerade fenotyp58.
Förutsägbarheten för interaktioner mellan värd och patogener kan utnyttjas för en mängd olika tillämpningar: målspecifika onkolytiska virus terapier. de-riskera levande virusvacciner; förfining, förutsägelse eller urval av djurmodeller; förutsägelse av värd-spänna eller mottaglighet; Prediktion av zoonotiska händelser. och Prediktion av Host-försvar. Eftersom metoderna som beskrivs är sekvensbaserade, kan de vara av värde att införliva i programvara i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Defense Threat minskning Agency (DTRA) projektnummer CB-SEED-SEED09-2-0061 och CBCall4-CBM-05-2-0019, och delvis av intramural/Extramural forskningsprogram av NCATS, NIH (XH) och marin forskning laboratorie bas fonder.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |