In vitro reconstitutie van ruimtelijke Celcontactpatronen met geïsoleerde Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen
Summary
Weefsel complexiteiten van multicellulaire systemen Verwar de identificatie van causaal verband tussen extracellulaire cues en individuele cellulaire gedragingen. Hier presenteren we een methode om de directe link tussen contact afhankelijke signalen en delings assen te bestuderen met behulp van C. elegans embryo blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen.
Abstract
In multicellulaire systemen worden individuele cellen omringd door de verschillende fysische en chemische signalen die afkomstig zijn van naburige cellen en het milieu. Deze weefsel complexiteit constideert de identificatie van causaal verband tussen extrinsieke signalen en cellulaire dynamiek. Een synthetisch gereconstitueerd multicellulair systeem overkomt dit probleem door onderzoekers in staat te stellen voor een specifieke Cue te testen terwijl ze anderen elimineren. Hier presenteren we een methode om celcontactpatronen te reconstitueren met geïsoleerde Caenorhabditis elegans blastomere en zelfklevende polystyreen kralen. De procedures betreffen het verwijderen van eierschalen, het isoleren van blastomere door het verstoren van de celcelhechting, de bereiding van zelfklevende polystyreen kralen en de reconstitutie van celcel-of celkraal contact. Tot slot presenteren we de toepassing van deze methode om de oriëntatie van cellulaire delings assen te onderzoeken die bijdraagt aan de regulering van ruimtelijke cellulaire patronen en specificatie van het lot van cellen bij de ontwikkeling van embryo’s. Deze robuuste, reproduceerbare en veelzijdige in vitro-methode maakt de studie mogelijk van directe relaties tussen ruimtelijke celcontactpatronen en cellulaire reacties.
Introduction
Tijdens multicellulaire ontwikkeling worden het cellulaire gedrag (bv. delings as) van individuele cellen gespecificeerd door verschillende chemische en fysieke aanwijzingen. Om te begrijpen hoe individuele cellen deze informatie interpreteert, en hoe ze de multicellulaire assemblage reguleren als een emergente eigenschap is een van de ultieme doelen van morfogenese studies. Het modelorganisme C. elegans heeft aanzienlijk bijgedragen tot het begrijpen van de cellulaire regulering van de morfogenese zoals cel polariteit1, Cell Division patronen1, cel Fate decision2, en weefsel schaal verordeningen zoals neuronale bedrading3 en organogenese4,5. Hoewel er verschillende genetische hulpmiddelen beschikbaar zijn, zijn weefsel engineering methoden beperkt.
De meest succesvolle weefseltechnische methode in C. elegans Study is de klassieke blastomere Isolation6; Als C. elegans embryo is omgeven door een eierschaal en een permeabiliteit barrière7, hun verwijdering is een van de belangrijkste procedures van deze methode. Hoewel deze blastomere-isolatiemethode het oplossen van celcelcontact op een vereenvoudigde manier mogelijk maakt, staat het niet toe dat ongewenste signalen worden weggenomen; celcontact vormt nog steeds zowel mechanisch (bijv. adhesie) als chemische aanwijzingen, waardoor ons vermogen om het oorzakelijke verband tussen de Cue en het cellulaire gedrag volledig te analyseren, wordt beperkt.
De in dit artikel gepresenteerde methode maakt gebruik van carboxylaat gemodificeerde polystyreen parels die covaltig kunnen binden aan elke amine-reactieve moleculen, waaronder eiwitten als liganden. Met name gebruikten we een amine-reactieve vorm van Rhodamine Red-X als een ligand om kralen zowel visueel traceerbaar en lijm aan de cel te maken. De carboxylgroepen van kraal oppervlak en primaire amine groepen van ligand molecuul worden gekoppeld door in water oplosbare Carbodiimide 1-ethyl-3-(Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDAC)8,9. Verkregen zelfklevende kralen zorgen voor de effecten van de mechanische Cue op cellulaire Dynamics10. We hebben deze techniek gebruikt om mechanische aanwijzingen te identificeren die nodig zijn voor de oriëntatie van de celdeling10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reconstitutie van vereenvoudigde celcontactpatronen laat onderzoekers de rollen van specifieke celcontactpatronen in verschillende aspecten van de morfogenese testen. We hebben deze techniek gebruikt om te laten zien dat de celdelings as wordt bestuurd door het fysieke contact met lijm parels10. Aangezien de specificatie van de delings assen cruciaal is voor multicellulaire ontwikkeling door bij te dragen aan morphogenesis14, stamcel divisie15,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken James Priess en Bruce Bowerman voor advies en het verstrekken van c. elegans stammen, Don Moerman, Kota Mizumoto, en Life Sciences Institute Imaging Core faciliteit voor het delen van apparatuur en reagentia, aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim voor het onderhoud van c. elegans en kritische lezing van ons manuscript. Ons werk wordt ondersteund door de Raad voor Natuurwetenschappen en ingenieurs onderzoek van Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
