In vitro ricostituzione dei modelli di contatto cellulare spaziale con Caenorhabditis isolato elegans Embrione Blastomeres e Perline in polistino adesivo
Summary
Le complessità tissutali dei sistemi multicellulari confondere l’identificazione della relazione causale tra segnali extracellulari e comportamenti cellulari individuali. Qui, presentiamo un metodo per studiare il legame diretto tra segnali dipendenti dal contatto e assi di divisione utilizzando i blastomeri embrionali C. elegans e le perle adesive in polistirolo.
Abstract
Nei sistemi multicellulari, le singole cellule sono circondate dai vari segnali fisici e chimici provenienti dalle cellule vicine e dall’ambiente. Questa complessità tissutale confonde l’identificazione del legame causale tra segnali estrinseci e dinamiche cellulari. Un sistema multicellulare sinteticamente ricostituito supera questo problema consentendo ai ricercatori di testare uno spunto specifico eliminandone altri. Qui, presentiamo un metodo per ricostituire i modelli di contatto cellulare con caenorhabditis elegans blastomere isolati e perline di polistirolo adesivo. Le procedure prevedono la rimozione del guscio d’uovo, l’isolamento del blastomere interrompendo l’adesione cellulare-cellula, la preparazione di perline di polistirolo adesivo e la ricostituzione del contatto cell-cell o cell-perad. Infine, presentiamo l’applicazione di questo metodo per studiare l’orientamento degli assi della divisione cellulare che contribuisce alla regolazione del patterning cellulare spaziale e delle specifiche del destino cellulare nello sviluppo degli embrioni. Questo metodo in vitro robusto, riproducibile e versatile consente di studiare le relazioni dirette tra i modelli di contatto delle cellule spaziali e le risposte cellulari.
Introduction
Durante lo sviluppo multicellulare, i comportamenti cellulari (ad esempio, l’asse di divisione) delle singole cellule sono specificati da vari segnali chimici e fisici. Comprendere come le singole cellule interpretano queste informazioni e come regolano l’assemblaggio multicellulare come proprietà emergente è uno degli obiettivi finali degli studi di morfogenesi. L’organismo modello C. elegans ha contribuito in modo significativo alla comprensione della regolazione a livello cellulare della morfogenesi come la polarità cellulare1,la divisione cellularemodello 1, la decisione del destino cellulare2e le regolazioni su scala dei tessuti come il cablaggio neuronale3 e l’organogenesi4,5. Anche se ci sono vari strumenti genetici disponibili, i metodi di ingegneria tissutale sono limitati.
Il metodo di ingegneria tissutale di maggior successo nello studio C. elegans è il classico isolamento blastomere6; poiché l’embrione di C. elegans è circondato da un guscio d’uovo e da una barriera di permeabilità7,la loro rimozione è una delle principali procedure di questo metodo. Mentre questo metodo di isolamento del blastomere consente la ricostituzione del contatto cellulare in modo semplificato, non consente l’eliminazione di segnali indesiderati; il contatto cellulare pone ancora segnali sia meccanici (ad esempio adadimento) che chimici, limitando così la nostra capacità di analizzare completamente la relazione causale tra il segnale e il comportamento cellulare.
Il metodo presentato in questo documento utilizza perline di polistirolo modificate carboxylate che possono legarsi covalentmente a qualsiasi molecola ammine-reattiva, comprese le proteine come ligandi. In particolare, abbiamo usato una forma ammine-reattiva di Rhodamine Red-X come ligando per rendere le perline tracciabili visivamente e adesivo alla cellula. I gruppi carboxyl di superficie di perline e gruppi di ammina primaria di molecola ligando sono accoppiati da carbodiimide solubile in acqua 1-ethyl-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Perline adesive ottenute consentono gli effetti del segnale meccanico sulla dinamica cellulare10. Abbiamo usato questa tecnica per identificare i segnali meccanici necessari per l’orientamento della divisione cellulare10.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricostituzione dei modelli di contatto cellulare semplificati consentirà ai ricercatori di testare i ruoli di specifici modelli di contatto cellulare in diversi aspetti della morfogenesi. Abbiamo usato questa tecnica per dimostrare che l’asse di divisione cellulare è controllato dal contatto fisico con perline adesive10. Poiché la specifica dell’asse di divisione è fondamentale per lo sviluppo multicellulare contribuendo alla morfogenesi14, divisione delle cellule st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo James Priess e Bruce Bowerman per la consulenza e la fornitura di ceppi C. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto, e Life Sciences Institute Imaging Core Facility per la condivisione di attrezzature e reagenti, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim per la manutenzione di C. elegans e la lettura critica del nostro manoscritto. Il nostro lavoro è supportato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
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