Summary
여기에서 우리는 정량적 PCR (qPCR)를 사용하여 검출된 후생유전학 서명을 통해 면역 세포 정체성 및 순도를 결정하는 강력한 방법을 기술합니다. 특정 궤적에서의 DNA 탈메틸화는 특정 세포 유형에 대한 고유 식별자역할을 하며 CD8+, 조절 또는 Th17 T 세포의 식별을 허용합니다.
Abstract
면역 세포 아류형 집단 주파수는 T 세포 치료의 효능에 큰 영향을 미칠 수 있다. 유세포 분석과 같은 현재 의 방법은 특정 샘플 요구 사항, 높은 샘플 입력이 있으며 처리량이 낮으며 표준화가 어렵기 때문에 개발 중에 세포 치료 제품의 특성화에 해롭고 제조.
본원에 기재된 이 검소한 유전체 DNA(gDNA)를 사용하여 세포의 이질적인 혼합물에서 면역 세포 유형을 정확하게 식별하고 정량화하는 검문. DNA 메틸화 패턴은 비설피테 변환을 통해 밝혀지며, 이는 메틸화되지 않은 시토신이 우라실로 변환되는 과정입니다. 메틸화되지 않은 DNA 영역은 변환된 영역을 대상으로 하는 프라이머를 사용하여 qPCR 증폭을 통해 검출됩니다. 분석당 하나의 고유 궤적이 측정되고 특정 세포 유형에 대한 정확한 식별자역할을 합니다. 이 어세이는 견고하며 CD8+, 조절 및 Th17 T 세포를 높은 처리량 방식으로 식별합니다. 이러한 최적화된 분석에는 잠재적으로 세포 치료 공정을 위한 공정 내 및 제품 방출 테스트에 사용될 수 있습니다.
Introduction
세포 면역 요법에 있는 T 세포의 사용은 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 기술1의출현과 함께, 지난 10 년간 현저하게 증가했습니다. T 세포 기지를 둔 치료는 중대한 임상 성공으로 충족되는 동안, 그(것)들은 이기종이고 세포 특성 및 정체성은 기증자 사이에서 현저하게 변화할 수 있습니다2. T 세포 인구의 이질성은 치료 효능에 큰 영향을 미칠 수 있으며 임상 시험에서 결론을 복잡하게. 이러한 이유로, T 세포 면역 요법의 최적 제형을 결정하기 위해 제품 제조 및 제형 동안 T 세포 이질성을 이해하는 것이 중요하다.
넓은 의미에서, T 세포는 두 그룹으로 나눌 수 있습니다: CD4+ 도우미 T 세포, 면역 조절 사이토 카인을 분비하는, 그리고 CD8+ 세포 독성 T 세포, 이는 직접 주요 조직 적합성 복합체에 동종 항원을 제시 하는 세포를 용해 (MHC) I 분자. CD4+ 도우미 T 세포는 사이토카인의 독특한 세트를 생성하는 특정 서브세트의 무수한으로 분화할 수 있습니다. 몇몇은 최종 세포 생성물에서 CD4+에 CD8+ T 세포의 정의된 비율이 생체 내 효험 및 지속성을 최대화한다는 것을 건의합니다 그러나 세포 제조를 복잡하게 할 수 있었습니다3. CD4+ T 세포의 하위 집합인 조절 T 세포(Tregs)는 면역 억제이며 면역 세포의 활성화를 감소시입니다. 조절 T 세포는 종양 내성을 중재하는 데 연루되어 있으며, CAR T 세포 제조 중에 존재하는 경우, CAR T 세포의 항종양 면역 반응을 억제할 수 있다4,5,6. T 도우미 17 (Th17) T 세포와 같은 다른 CD4+ 서브세트는 종양 클리어런스를 촉진하고 T 세포 치료의 효능을 높이기 위해 활용될 수 있다. 따라서, Th17 CD4+ T 세포를 증가시키는 것은 인터류키핀(IL-17)의 증가된 생산이 항종양 면역 반응을 촉진시키는 고형 종양 설정에서 특별한 관심을 갖는다5,7,8,9. 종양 반응에서 Th17 세포의 중요성을 이해하는 것은 시험관 에서 이 세포를 생성하는 전략에 더 많은 조사를 자극했습니다7,9. 따라서 이러한 T 세포 서브세트를 검출하는 방법은 T 세포 요법을 최적화하는 데 매우 중요하며 견고하고, 쉽고, 확장 가능하고, 재현가능해야 합니다.
유세포측정법은 면역 세포의 동일성을 결정하는 가장 일반적인 방법입니다. 그러나 유동 세포측정은 수확당일에 분석해야 하는 살아있는 그대로의 세포가 필요합니다. 세포내 사이토카인 염색(ICS)의 경우, T 세포 내에서 사이토카인을 유지하기 위해 단백질 분비 억제가 요구됩니다. 그러나, 상이한 억제제 화합물은 특정 사이토카인의 분비에 차동 효과를 가지며, 사용자가 관심 있는 사이토카인의 검출을 위한 특수 칵테일을 생성하도록강요10,11. 추가적으로, 유세포 분석의 충실도는 그들의 표적에 구체적이고 강력하게 묶는 항체 클론에 의존합니다. 상이한 항체 클론의 사용은 다양한 결과를 야기하고 부정확한 결론으로 이어질 수 있으며, 이 방법은 표준화하기 어렵다12. 또한, 유세포분석을 통해 수집된 데이터의 분석, 따라서 데이터로부터 도출된 결론은, 게이트가13,14를설정하는 방법에 따라 사용자 간에 크게 달라질 수 있다. 이러한 이유로 유세포측정은 세포 치료 개발 중 정확한 품질 관리에 적합하지 않습니다.
특정 유전자 층에서 게놈 메틸화의 평가는 세포 정체성을 결정하는 다른 방법입니다. 특정 세포 유형을 확인하기 위해 DNA 메틸화를 사용하는 근거는 여러 기사에서 기술되었으며 주어진 세포 집단15,16,17에존재하는 특정 메틸화 패턴에 의존한다. 표적 세포에서, 특정 사이트는 비 표적 세포에서 이 사이트가 메틸화되는 동안, 미수정 뉴클레오티드를 포함합니다. 이 패턴은 비설핏 변환을 통해 검출될 수 있으며, 이는 미메틸화된 시토신 뉴클레오티드(C)를 우라실(U)으로 독점적으로 변환하는 과정입니다. 프라이머와 프로브는 변환된 사이트에 대해 설계한 다음 qPCR16을통해 증폭 및 감지할 수 있습니다.
본원에 기재된 분석은 하우스키핑 유전자에 비해 특이적인 비메틸화 되지 않은 궤양의 수를 정량화함으로써 이기종 집단 내의 면역 세포 아류형의 빈도를 측정한다. CD8 B 유전자에 대한 미밀화되지 않은 조절 요소의 사본은 이 분석에서 CD8 분석, Treg의 FoxP3 및 Th17의 IL-17에서 측정된다. 이들 궤체는 관심 있는 특정 세포 집단(예를 들어, CD8+ T 세포)을 분리하고 그 세포 유형15에서만메틸화되지 않은 궤위를 식별하기 위해 비술피테 시퀀싱을 수행함으로써 확인되었다. 프라이머와 프로브는 고유하게 메틸화되지 않은 로시에 대해 개발되고 샘플은 qPCR을 통해 분석됩니다. 알려진 복사 번호의 표준 곡선은 높은 복사 번호 표준 plasmid의 희석에서 생성되어 Ct 값을 전사자 복사 번호로 변환할 수 있습니다.
분석 성능을 평가하기 위해 기준 gDNA 및 교정기 플라스미드를 포함한 제어 샘플이 필요합니다. 기준 게놈 물질은 공지된 면역 세포 주파수를 가진 다중 기증자로부터 풀화된 혈액 샘플이며 품질 관리(QC) 분석 성능 검사에 사용된다. 교정기 샘플은 CD8, FoxP3 및 GAPDH 유전자 서열을 등등 비율로 포함하는 합성 플라스미드이다. 이는 비설핏 변환 효율의 척도로서 사용되며, 이는 상이한 게놈 영역 내의 비설핏 변환이 효율에서 변화하기 때문이다. 캘리브레이터 내의 GAPDH에 대한 타겟의 비율은 1이지만, 비설핏 변환 효율의 차이로 인해, 비율은 다를 수 있다. 이러한 캘리브레이션 인자는 CD8 및 Treg 세포에 적용된다. Treg 분석에 사용된 유전자인 FoxP3는 X 염색체에 있습니다. 이 분석법은 FoxP3의 미수정 사본만을 측정하고 FoxP3의 사본은 Tregs에서 메틸화되지 않기 때문에, 이 분석법은 성불가지론이며 남성 및 여성 샘플18과함께 사용할 수 있습니다. Th17 분석은 교정기 샘플 또는 GAPDH를 하우스키핑 유전자로 사용하지 않습니다. 대신, 비-Th17 세포에 존재하는 메틸화된 궤위를 표적화하는 또 다른 프라이머 세트가 포함되고 총 세포 수는 IL-17의 메틸화 및 미메틸화 사본의 합에 의해 반영된다. qPCR에서 얻은 데이터는 데이터에 대한 품질 관리 검사를 수행하고 시작 채우기 내에서 대상 셀의 백분율을 계산하는 사전 설정 분석 템플릿에 입력됩니다. 이를 통해 자동화되고 공정한 데이터 분석을 제공하여 사용자 주관성을 제거하고 표준화 기능을 개선할 수 있습니다.
이 분석은 배양 된 또는 고정 된 세포, 또는 냉동 된 세포 펠릿을 사용하여 백병 증 절차에 의해 분리 될 수있는 gDNA를 사용합니다. 낮은 시료 요구 사항, 시료 시작 재료의 유연성, 높은 정확도 및 표준화 된 분석은 유세포 측정과 관련된 한계를 해결하며 세포 치료 공정 개발 중 품질 관리 목적으로 이상적입니다.
Protocol
모든 인간 샘플은 인간 연구 윤리에 대한 지침에 따라 상업적 출처에서 얻어졌습니다.
1. 게놈 DNA 격리
참고: 게놈 DNA 분리는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 정제된 T 세포 또는 기타 조혈 세포 유형과 같은 임의의 조혈 세포로부터 시판되는 키트(재료 표참조)를 사용하여 수행됩니다. 본 실험에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 T 세포는 3개의 상이한 인간 공여자로부터 사용하였다.
- 원원관에 1-2 x 106 조혈 세포를 놓고 원심 분리기를 400 x g에서 10 분 동안 놓습니다.
- 상급을 완전히 흡인합니다.
- 350 μL의 용해/결합 버퍼를 시료에 넣고 55°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 50 μL의 단백질나제 K(20 mg/mL)를 350 μL의 세포 현탁액과 30초 동안 와류에 넣습니다.
- DNA 결합 파라마그네틱 비드 50 μL과 100% 이소프로판올 400 μL을 넣고 실온(RT)에서 3분 동안 배양합니다.
- 튜브를 자기 랙에 2 분 동안 놓고 구슬을 방해하지 않도록주의하면서 상급기를 제거하십시오. DNA는 이 단계에서 자기 구슬에 결합됩니다.
- 세척 버퍼 1의 950 μL을 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 및 반복 단계 1.6.
- 1.7단계를 반복합니다.
- 세척 버퍼 2의 950 μL을 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 및 반복 단계 1.6.
- 용출 완충제와 소용돌이 100 μL을 2분 동안 추가합니다.
- 조혈 세포로부터 분리된 gDNA의 1 μL을 사용하여 260 nm, 280 nm 및 230 nm에서 OD를 획득하여 형광계를 사용하여 분광광도에 의해 gDNA의 순도를 측정하였다. 260및 280 nm의 광학 밀도(OD 비)의 비율이 1.7-2.0이고 260과 230 nm의 OD 비율이 1.5-2.4 사이인지 확인합니다.
2. 견본 준비
- 써모믹서를 56°C로 예열합니다.
- 모든 시료, 교정기 및 기준 재료에 대해 2mL 튜브에 라벨을 부착합니다.
- RT에서 용출 버퍼(1단계에 사용되는 키트와 함께 사용 가능)로 샘플 및 교정기와 교정기를 희석합니다.
- 모든 실험 샘플의 경우 gDNA를 총 부피 142 μL로 희석합니다. 예를 들어, 100 ng/μL에서 gDNA 4 μL을 용출 완충액 138 μL로 희석합니다.
참고: 400-1,200 ng의 gDNA는 분석에 사용될 수 있다. - 교정기의 75 μL을 총 부피 142 μL로 희석합니다.
- TE(pH = 8.0)를 공백으로 사용하여 분광광도계를 사용하여 기준 gDNA 농도를 확인합니다.
- 기준 gDNA의 1,000-1,200 ng를 총 부피 142 μL로 희석한다. 예를 들어, 100 ng/μL에서 기준 gDNA 10 μL을 용출 완충액 132 μL로 희석합니다.
- 모든 실험 샘플의 경우 gDNA를 총 부피 142 μL로 희석합니다. 예를 들어, 100 ng/μL에서 gDNA 4 μL을 용출 완충액 138 μL로 희석합니다.
- 열믹서에서 900 rpm에서 5분 동안 56°C에서 튜브를 배양합니다. 샘플을 수집하기 위해 튜브를 잠시 회전시다.
3. 비술핏 변환
참고: 비설핏 변환 중 의 배양 시간이 권장 시간을 따르도록 합니다. 과다 배양 또는 언더 배양은 분석의 결과에 영향을 미칠 것입니다.
- 써모믹서를 80°C로 설정합니다.
- 모든 튜브에 270 μL의 암모늄 비설핏과 90 μL의 테트라하이드로푸르퓨리엘 알코올(THFA)을 첨가합니다. 소용돌이는 완전히 혼합하고 짧게 바닥에 액체를 수집하기 위해 샘플을 회전.
- 900 rpm에서 45 분 동안 80 °C에서 열믹서에 튜브를 배양합니다. 열 블록을 사용하는 경우, 배양 동안 4.5 분마다 1-2 s의 튜브를 소용돌이.
- 샘플을 간단히 스핀다운하고 4단계 또는 5단계로 계속하기 전에 3-5분 동안 RT로 냉각시다. 최종 부피는 ~500 μL이어야 합니다.
4. CD8 및 트레그 어세이
- 비설핏 변환 후 DNA 정제
참고: 이 단계는 비설핏 변환 DNA상에서 시판되는 DNA 정제 키트(재료 표참조)를 사용하여 수행됩니다. 사용하기 전에 시약이 RT로 데워져 있는지 확인하십시오.- 정제를 시작하기 전에, 30s. 병에 열거된 부피를 따라 세척 완충액에 에탄올과 이소프로판올을 첨가하여 DNA 격리 파라마그네틱 비드의 균질혼합물을 만들고, 열 블록을 65°C로 설정한다.
- RT에서 3.4 단계에서 각 튜브에 870 μL의 용해 /결합 버퍼와 105 μL의 DNA 결합 파라마그네틱 비드를 추가하십시오. 소용돌이는 완전히 혼합하고 잠시 튜브를 회전합니다.
- 570 μL의 2-프로판올과 와류를 넣고 완전히 섞으세요.
- 온도 믹서 또는 표준 회전 믹서에서 50 rpm에서 7 분 동안 RT에서 튜브를 배양하십시오.
- 튜브를 간단히 회전시면 됩니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 5분 동안 배양합니다.
- 샘플을 마그네틱 랙에 계속 고정하면 구슬을 방해하지 않고 상급을 제거하십시오.
참고 : DNA는 구슬에 바인딩됩니다. - 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 900 μL의 세척 버퍼 1을 추가합니다. 튜브를 소용돌이로 하여 구슬을 완전히 다시 일시 중단한 다음 튜브를 잠시 회전시면 됩니다.
- 튜브를 마그네틱 랙으로 되돌리고 3분 동안 배양합니다.
- 샘플을 마그네틱 랙에 계속 고정하면 구슬을 방해하지 않고 상급을 제거하십시오.
- 세척(4.1.7-4.1.9)을 한 번 세척 버퍼 1로 반복한 다음 세척 버퍼 2로 두 번 반복합니다.
- 상급체를 제거한 후 튜브를 잠시 회전시키고 3분 동안 마그네틱 랙으로 돌아갑니다.
- 잔류 세척 버퍼 2를 모두 제거하고 마그네틱 랙에서 튜브를 제거합니다.
- 튜브 뚜껑을 65°C에서 15분 동안 열어 놓은 구슬을 건조시다.
- 각 튜브에 60 μL의 용출 버퍼를 추가하고 1,400 rpm에서 7 분 동안 RT에서 배양하십시오. 대안적으로, 폼 어댑터를 사용하여 적당한 속도로 와류를 사용한다.
- 튜브를 짧게 회전시키고 자기 랙에 2분 간 놓습니다.
- 55 μL의 용출을 구슬을 방해하지 않고 새로운 튜브로 옮김. 용리액은 비설핏 변환 DNA를 함유하고 있습니다. DNA 농도를 측정하는 것은 필요하지 않습니다.
- qPCR 설정 및 실행
- qPCR 컴퓨터와 소프트웨어를 작동하는 컴퓨터를 켭니다.
- 소프트웨어 사용자 인터페이스에서 새 실험을 만들고 실험을 실행하는 데 사용되는 블록을 선택합니다.
- 표준 곡선을 실험 유형으로 선택합니다.
- 해당하는 경우 사용할 검출 화학을 선택합니다. 이 분석은 TaqMan 시약을사용합니다. 그렇지 않으면 ROX를 수동 참조로 선택합니다.
- 해당하는 경우 표준으로실행되는 계측기의 속성을 선택합니다.
- 대상(예: FAM을 리포터로 사용하는 GAPDH 또는 CD8)과 비형광 퀘이커를 할당하여 실험 설계를 정의합니다.
- 표준, 샘플 및 컨트롤에 대한 샘플 이름을 지정합니다.
- 다음으로, qPCR 플레이트에 따라 각 웰 포지션을 할당합니다. 각 웰은 CD8 또는 GAPDH와 같은 대상과 샘플 이름을 필요로 합니다. 각 샘플은 삼중으로 실행되며 계측기의 플레이트 레이아웃에 반영되어야 합니다.
- 각 표준을 작업 표준으로 지정하고 표 1에따라 최종 복사 번호를 지정합니다.
- 샘플, 교정기 할당 및 알 수 없음작업을 참조합니다.
- 템플릿 컨트롤이 없는 웰을 NTC 또는 N.
- 표준으로 사용할 람다 DNA(10 ng/μL)의 직렬 희석을 준비합니다(표 1참조).
- qPCR 마스터 믹스 칵테일을 준비, 대상 셀 유형에 대한 하나 와 GAPDH에 대한 하나 (표 2참조). 모든 샘플, 표준 및 NTC 제어를 세 배로 실행합니다.
참고: GAPDH는 총 셀 수를 정량화하는 데 사용되며 대상 증폭과 병행하여 실행됩니다. CD8 B 유전자에 대한 미수정 조절 요소의 사본은 CD8 분석, Treg의 FoxP3 및 Th17의 IL-17에서 측정됩니다. - qPCR에는 96웰 플레이트를 사용합니다. 먼저 우물에 템플릿 DNA의 3 μL을로드합니다. 다음으로, 마스터 믹스의 7 μL을 로드한다.
- qPCR 필름으로 플레이트를 밀봉하고 qPCR 계측기에 넣기 전에 플레이트를 잠시 회전시면 됩니다.
- 표 3과같이 qPCR을 실행합니다.
- 실행이 완료되면 qPCR 데이터를 .txt 또는 .xlsx 파일로 내보냅니다.
- CD8 분석및 Treg 분석(재료 표참조)에 대한 분석 템플릿을 사용하여 데이터를 분석하여 Ct 평균, Ct 표준 편차 및 복사 번호를 계산합니다.
| 초기 플라스미드 카피 수/3 μL | 볼륨 | 희석제 DNA [1] | 3 μL당 최종 복사 번호 | 레이블 |
| 31250 | 1000 μL | - | 31250 | STD #1 |
| 31250 | 200 μL | 800 μL | 6250 | STD #2 |
| 6250 | 200 μL | 800 μL | 1250 | STD #3 |
| 1250 | 200 μL | 800 μL | 250 | STD #4 |
| 250 | 200 μL | 800 μL | 50 | STD#5 |
| 1250 | 30 μL | 1200 μL | 30 | STD #6 [2] |
| [1] TE에서 10 ng/μL 람다 DNA (10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8.0) | ||||
| [2] STD #3을 사용하여 STD#6을 준비합니다. | ||||
표 1: 표준 희석제의 준비. 31250-30 사본에 걸친 4 로그 희석 기준은 희석제로서 TE/람다 DNA를 사용하여 표에 따라 제조되었다. CD8 및 GAPDH 모두에 동일한 표준 희석이 사용되었습니다. 표준은 -20°C에서 보관하였다.
| 시약 | 금액 |
| 람다 DNA (TE에서 50 ng/μL, pH8.0) | 1 μL |
| 타크만 분석 | 0.5 μL |
| 물, 뉴클레아제 프리 | 0.5 μL |
| 마스터 믹스 | 5 μL |
| 총 | 7 μL |
표 2: qPCR 칵테일 의 준비. 테이블에 따른 템플릿 DNA를 제외한 CD8 및 GAPDH에 대해 각각 하나씩 두 개의 별도 튜브로 qPCR 마스터 믹스를 준비합니다.
| 단계 | 시간 | 임시 | 사이클 |
| 배양 전 | 약 35분 | 95°C | 1X |
| 증폭 | 15초 | 95°C | 50배 |
| 1분 | 61°C | ||
| 재사용 대기 시간 | 5초 | 42°C | 1X |
표 3: CD8 및 Treg 분석에 대한 qPCR 실행 파라미터. qPCR은 테이블에 지정된 매개 변수에 따라 실행되었습니다.
5. Th17 분석
- 비설핏 변환 후 DNA 정제
- 섹션 4.1에 설명된 대로 정제 단계를 수행합니다.
- 샘플을 용출하려면 각 튜브에 25 μL의 용출 버퍼를 추가하고 1,400 rpm에서 7 분 동안 RT에서 배양하십시오. 대안적으로, 폼 어댑터를 사용하여 적당한 속도로 와류를 사용한다.
- 튜브를 짧게 회전시키고 자기 랙에 2분 간 놓습니다.
- 20 μL의 용출을 구슬을 방해하지 않고 새로운 튜브로 옮김. 용리액은 비설핏 변환 DNA를 함유하고 있습니다.
- DNA 전암화
참고 : DNA 전암화는 qPCR19를통해 정확한 정량화를 위해 낮은 풍부도 목표에 권장됩니다. Th17 메틸화 분석법은 이러한 이유로 전암화를 요구하도록 설계되었습니다.- 비설핏 변환 DNA의 2 μL을 PCR 스트립 튜브로 옮김. 2 μL의 물로 NTC 튜브를 만듭니다.
- 모든 샘플에 대한 사전 증폭 마스터 믹스를 만듭니다(표 4참조).
- 각 튜브에 마스터 믹스 23 μL을 추가합니다. 튜브, 소용돌이를 캡하고 튜브를 잠시 회전시면 됩니다.
- 가열된 뚜껑을 사용하여 열자전거에서 프리앰프 프로토콜을 실행합니다. (표5). 달리기가 끝나면 튜브를 잠시 돌릴 수 있습니다.
- 증폭된 DNA의 2 μL을 새로운 튜브로 옮기고 78 μL의 물을 추가하여 샘플을 1:40으로 희석시냅니다.
- qPCR 설정 및 실행
- 섹션 4.2를 따라 qPCR을 설정하고 실행합니다.
- Th17 분석(재료 표 참조)에대한 분석 템플릿을 사용하여 데이터를 분석하여 Ct 평균, Ct 표준 편차 및 복사 번호를 계산합니다.
| 시약 | 금액 |
| 물, 뉴클레아제 프리 | 9.5 μL |
| 핫 스타트 PCR 마스터 믹스 | 12.5 μL |
| Th17 PCR 프라이머 | 1 μL |
| 총 | 23 μL |
표 4: Th17 분석에 대한 DNA를 미리 증폭한다. 사전 증폭 반응 마스터 믹스를 테이블에 따라 제조하였다.
| 단계 | 시간 | 임시 | 사이클 |
| 배양 전 | 약 35분 | 95°C | 1X |
| 변성 | 1분 | 95°C | 12배 |
| 어 닐 링 | 45초 | 55°C | |
| 신장 | 30초 | 72°C | |
| 최종 신장 | 약 10분 | 72°C | 1X |
| 개최 | 무기한 | 4°C |
표 5: Th17 DNA를 프리앰프. Th17 DNA는 실제 qPCR 전에 12사이클 동안 미리 증폭되었다.
Representative Results
모든 3개의 메틸화 검사는 gDNA의 입력으로 시작하고 전체 세포 집단 내의 CD8+ T 세포, Treg, 또는 Th17 세포의 백분율 귀착됩니다. 다음 의 비설핏 변환 후 qPCR로부터 생성된 데이터는 제공된 분석 템플릿을 사용하여 분석하였다. 이 템플릿은 표준 샘플에서 얻은 표준 곡선을 사용하여 테스트 샘플의 대상 및 총 셀 수의 복사 수를 추정했습니다. 백분율 셀 유형은 분석 템플릿에 통합된 수식을 사용하여 계산되었습니다. 도 1은 CD8+ 분석에서 대표적인 데이터를 나타내고, 유세포 분석및 기재된 메틸화 분석을 모두 사용하여 3개의 상이한 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 T 세포를 모두 분석하여 얻은 것이다. 두 세포 모형에 있는 모든 기증자에 걸쳐 2개의 방법 사이 동향은 유사했습니다. 도 2는 Treg 분석에서 대표적인 데이터를 나타낸다. 3개의 정제된 Treg 공여체는 메틸화 기반 qPCR 및 유세포 측정을 모두 사용하여 분석되었고, 결과는 표시된 그래프에 플롯되었다. 두 방법 모두에 대한 결과는 비교적 유사했습니다. 그러나 모든 경우에 유세포계는 더 높은 값을 산출했습니다. 도 3은 유세포분석 및 메틸화를 통해 검출된 Th17 세포의 비교를 나타낸다. 이 그래프에서는 실험 방법에 대한 자극 및 자극되지 않은 조건이 있습니다. 세포는 PMA 및 요오마이신을 통한 자극을 필요로 하며, 단백질 수송 억제제와 함께 각 세포 내에 존재하는 IL-17A의 양을 증가시키기 위해유세포세포측정20을통해 검출될 수 있다. 메틸화 상태는 자극 상태에 관계없이 검출될 수 있다. 유세포분석은 메틸화와 비교했을 때 Th17 세포의 낮은 수준을 산출하였다. 분석법의 민감도 및 특이성은 표 6에표시된 블랭크(LOB), 검출 한계(LOD), 정량(LOQ) 값의 한계에 의해 입증되었다.
도 1: 3개의 상이한 공여체를 위한 PBMC 및 T 세포 둘 다를 위한 CD8+ 백분율의 흐름 및 메틸화 비교. 3개의 상이한 공여체로부터의 PBMC 및 T 세포는 유세포분석 또는 메틸화를 사용하여 전체 집단에서 CD8+ T 세포의 백분율을 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 3개의 상이한 기증자에 대한 정제된 Treg에 대한 트레그 백분율의 흐름 및 메틸화 비교. 정제된 Treg 세포는 유세포분석 또는 메틸화를 사용하여 전체 집단에서 Treg 세포의 백분율에 대해 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 자극 및 비자극 실험군에 대한 Th17 백분율의 흐름 및 메틸화 비교. 자극및 자극되지 않은 T 세포는 유세포분석 및 메틸화를 모두 사용하여 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시험 | Lob | Lod | 로크 (주) |
| CD8 | 0 | 19 | 52 |
| 갭드 (것)가프 ( | 0 | 7 | 21 |
| 폭스P3 | 0 | 3 | 12 |
| Th17 TpG | 0 | 35 | 73 |
| Th17 CpG | 0 | 38 | 73 |
표 6: LoB, LoD, 메틸화 기반 아세에 대한 카피 번호의 LoQ. 분석법의 민감도 및 특이성은 MIQE 가이드라인21,22에의해 얻어진 LoB, LoD 및 LoQ 값에 의해 상세히 설명된다. 일반적으로, 적은 40 사본은 정확하게 이 검정에 의해 검출될 수 있습니다.
Discussion
새로운 면역 치료제의 출현과 함께 면역 세포 정체성과 순도를 감지하는 표준화 된 방법이 필요합니다. 견고하고 검증되고 확장 가능한 공정 내 및 방출 테스트를 위한 평가 방법은 여전히 확립되고 세포 기반 치료법의 상용화에 큰 도전과제를 제기하고 있습니다. 유세포측정법은 현재 면역 세포 자형질에 가장 흔한 방법이지만, 높은 시료 품질과 수량 요구량은 일반 사용을 어렵게 만듭니다. 또한, 우수 제조 관행(GMP) 환경에서 유세포분석의 구현은 작업자 의존적 게이팅 전략 및 사용되는 각 마커에 대한 기준 표준의 요구 사항에 의해 제한된다13,14. 자동 게이팅은 분석의 견고성을 향상시키는 것으로 나타났지만 아직 확립된 품질 관리 전략은 아닙니다. 유전자 발현 프로파일링은 또한 세포 치료 생성물 의 정체성 및 순도를 특성화하는데 사용될 수 있지만, 데이터는 반정적 및 노동 집약적이다. 추가적으로, RNA와 microRNA는 DNA 보다는 상대적으로 보다 적게 안정하고 견고하고 재현가능한 결과의 부족에 기여할 수 있습니다. 따라서, 특정 궤적의 후성유전학적 DNA 메틸화 상태를 활용하면 관심 있는 세포 유형을 식별하고 정량화하는 안정적이고, 수행하기 쉽고, 견고하고, 확장 가능한 방법을 제공한다.
표현형 세포에 메틸화 패턴의 검출은 3개의 중요한 단계에 의존합니다: 첫째, 분석법은 기술된 방법에 따라 단리되는 gDNA의 사용을 요구합니다. 고품질 DNA가 필요하며 사용하지 않을 경우, 이중질화 변환은23,24에영향을 받을 수 있다. 낮은 품질의 DNA를 얻을 경우, 추가 정제는 분석 신뢰성을 보장하기 위해 권장됩니다. 둘째, 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 성공적으로 비설핏으로 변환하는 것이 요구된다. 비설핏 변환에서 가장 중요한 단계는 DNA 변성23,25입니다. 나트륨 비설피테와 는 달리, 암모늄 바이설피테를 이용한 고온 변성, 변환 효율 및 일관성을 증가시키고 이들 분석은25,26에권장되는 과정이다. 사용자는 반응이 80 °C에서 발생하고 샘플 혼합이 자주 수행되도록해야합니다. 이러한 이유로 디지털 써모믹서를 사용하는 것이 좋습니다(재료 표참조). 셋째, 적절한 파이펫팅 기술은 qPCR 준비 중에 따라야 한다. 정량적 실시간 PCR 실험(MIQE)가이드라인(27)의출판을 위한 최소 정보를 준수하기 위해 qPCR 반응 동안 3개의 기술적 복제가 요구된다. 더 많은 기술 복제를 포함할 수는 있지만 필수는 아닙니다. 부적절한 파이펫팅 기술 및/또는 기술 복제를 포함하지 않는 것은 신뢰할 수 없는 qPCR 결과를 초래할 수 있습니다.
중요한 단계를 따르고 원하는 결과를 아직 얻지 못하면 분석 내의 여러 컨트롤을 활용하여 문제를 정확히 파악할 수 있습니다. 적절한 양산염 변환은 이 분석에서 가장 중요한 단계입니다. 부적절한 바이설피테 변환은 해석 템플릿에 의해 계산된 실패한 교정 계수 및/또는 기준 값에 의해 강조 표시됩니다. 비설핏 변환이 잘못 수행된 경우(예를 들어, RT에서 반응이 수행된 경우), qPCR 동안 증폭되지 않을 것이다. 또한, qPCR 반응 제제 동안 에러가 발생하였다면 증폭이 보이지 않을 것이다(예를 들어, qPCR 마스터 믹스가 첨가되지 않은 경우). 이러한 두 가지 문제는 표준 샘플을 조사하여 분리할 수 있습니다. 표준 샘플에서 의 증폭은 기준, 교정기 및 실험 샘플이 아닌, 바이설피테 변환이 올바르게 수행되지 않았다는 것을 나타낼 것이다. 어떤 샘플에서도 증폭되지 않으면 qPCR이 올바르게 수행되지 않았다는 것을 나타냅니다.
이 분석은 다른 자형질 분석 방법, 특히 유량 세포측정과 관련된 엄격한 샘플 요구 사항 및 분석 변동성을 해결하는 반면, 주목해야 할 한계가 있습니다. 이 분석은 유세포측정법으로 일반적으로 수행되는 다중화 분석을 금지하는 표적 세포에 대한 고유 식별자로 사용되는 단일 궤적을 대상으로 합니다. 이것은 Th17 같이 복잡한 세포 모형을 확인하는 것을 어렵게 만듭니다. 그러나, 단일 궤적에서 메틸화 패턴의 사용은 다중 세포의 정확한 표현형 마커인 것으로 나타났으며 다중 임상 시험15,16에서사용되어 왔다. 이는 특히 FOXP3 메틸화 시그니처를 평가하는 것이 일시적인 FOXP3 발현세포(28)로부터진정한 트레그를 검출하는 정확하고 모호한 방법인 트레그에서 특히 그렇다. 다중분석의 손실은 심문된 궤적의 정확도에 의해 보상된다. 분석법의 미래 반복은 하나의 qPCR 반응에서 다중 궤적의 검출을 허용하는 다중 qPCR 염료 및 quenchers를 포함할 수 있었다.
이러한 분석법은 세포 표현형 및 정체성을 결정하는 유세포측정을 위한 대체 방법으로 사용될 수 있다. 이 분석은 세포 분석이 수행하는 정확한 값을 산출하지 않는다는 점에 유의해야합니다(그림 1-3). 이는 부분적으로 유세포분석과 관련된 데이터 분석의 가변성 때문입니다. 게이팅 전략에 따라 유세포분석의 결과는 크게 달라질 수 있습니다. 이는 특히 복잡한 염색 프로토콜을 사용하여 IL-17과 같은 세포내 표적을 살펴보면, 여기서 변이계수(CV)는 15%14만큼높을 수 있다. 여러 사용자 들 사이에서, 일관되게 제시된 분석의 CV는 <15%의, 분석의 견고성을 지원하고 향상된 표준화 기능을 가졌다. 후성유전학과 유동 세포분석계 표현형의 가장 큰 차이는 세포 자극이 필요할 때 볼 수있다(그림 3). 유세포분석기를 통한 Th17 세포의 검출은 T 세포 자극 및 세포내 사이토카인염색29,30,31에대한 공통 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 후성유전학 측정과 유세포 분석 사이의 Th17 자형질에서 볼 수 있는 차이는 IL-17 생산의 역학 때문일 수 있습니다. 메틸화 시그니처가 안정되어 있는 동안, 단백질 생산은 시간이 걸리고 형광 항체20,32에의해 검출될 수 있는 충분한 양으로 존재해야 한다. 단백질 수송 억제제 및 세포 자극 칵테일을 가진 6 시간 배양후유전학 기지를 둔 표현형 방법을 통해 검출된 Th17 세포의 수준을 보기 위하여 확장될 필요가 있을 수 있습니다. 값이 일치하지 않는 정확한 이유를 결정하고 가장 정확한 자형질 변환 방법을 결정하기 위해 더 많은 연구가 필요합니다.
이 보고에서는, 우리는 간단하고 강력한 방식으로 세포의 이기종 혼합물에 있는 면역 세포 모형을 확인하고 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 치료법은 세포 기반 치료제의 공정 및 방출 테스트에 대한 잠재적 사용을 위해 설계 및 최적화되었습니다. 기재된 시험은 세포 치료 응용분야에서 사용되는 고도의 자격을 갖춘 원료에 대한 요구 사항을 충족합니다. 유세포 분석 및 안정성, 시료 요구 사항, 사전 자극, 세포 내 염색을 위한 세포 투과율 및 데이터 분석의 주관성과 같은 다른 분자 방법의 단점을 해결함으로써, 기술된 분석은 일렬로 세워집니다. 세포 기반 치료의 상용화를 목표로 하고 있습니다.
Disclosures
수만 K. 프라드한, 제리 구즈만, 칼 다르기츠, 마크 랜던, 우마 락시미병증은 써모 피셔 사이언티픽에 의해 고용된다. 스벤 올렉, 비에른 사만스, 울리히 호프뮬러는 각각 에피온티스의 창립자이자 직원이다. 이 원고의 제작에는 글쓰기 지원이 전혀 활용되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 써모 피셔 과학 교내 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
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