Eine Ratte Carotis Arterie Druck-kontrollierte segmentale Ballonverletzung mit periadventitialen therapeutischen Anwendung
Summary
Die Ratten-Carotis-Arterie Ballon-Verletzung imitiert das klinische Angioplastie-Verfahren zur Wiederherstellung des Blutflusses in atherosklerotischen Gefäßen. Dieses Modell induziert die arterielle Verletzungsreaktion, indem es die arterielle Wand distend und die Intimschicht von Endothelzellen denudiert, was letztlich zu einer Umgestaltung und einer intimalen hyperplastischen Reaktion führt.
Abstract
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind nach wie vor die häufigste Todesursache und Behinderung weltweit, zum Teil aufgrund von Arteriosklerose. Atherosklerotische Plaque verengt die luminale Oberfläche in den Arterien und reduziert so den ausreichenden Blutfluss zu Organen und distalen Geweben. Klinisch zielen Revaskularisationsverfahren wie Ballonangioplastie mit oder ohne Stentplatzierung darauf ab, den Blutfluss wiederherzustellen. Obwohl diese Verfahren den Blutfluss wieder herstellen, indem sie die Plaquebelastung reduzieren, beschädigen sie die Gefäßwand, die die arterielle Heilungsreaktion einleitet. Die verlängerte Heilungsreaktion verursacht arterielle Resensibilisierung oder eine erneute Verengung, was letztlich den langfristigen Erfolg dieser Revaskularisationsverfahren einschränkt. Daher sind präklinische Tiermodelle integraler Bestandteil für die Analyse der pathophysiologischen Mechanismen, die die Restenose antreiben, und bieten die Möglichkeit, neuartige therapeutische Strategien zu testen. Murine Modelle sind billiger und einfacher zu bedienen als große Tiermodelle. Ballon- oder Drahtverletzungen sind die beiden allgemein akzeptierten Verletzungsmodalitäten, die in murinen Modellen verwendet werden. Insbesondere Ballonverletzungsmodelle imitieren das klinische Angioplastieverfahren und verursachen ausreichende Schäden an der Arterie für die Entwicklung der Restenose. Hierin beschreiben wir die chirurgischen Details für die Durchführung und histologische Analyse des modifizierten, druckgesteuerten Ratten-Carotis-Arterien-Verletzungsmodells. Darüber hinaus zeigt dieses Protokoll, wie lokale periadventitelle Anwendung von Therapeutika verwendet werden kann, um neointimale Hyperplasie zu hemmen. Schließlich präsentieren wir die Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie als neuartigen Ansatz zur Abbildung und Visualisierung der arteriellen Verletzung in drei Dimensionen.
Introduction
Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) bleibt weltweit die häufigste Todesursache1. Atherosklerose ist die zugrunde liegende Ursache für die meisten CVD-bedingten Morbiditätunden. Atherosklerose ist die Ansammlung von Plaque in arterien, die in einem verengten Lumen führt, die ordnungsgemäße Blutdurchblutung zu Organen und distalen Geweben behindert2. Klinische Interventionen zur Behandlung schwerer Arteriosklerose sind Ballonangioplastie mit oder ohne Stentplatzierung. Diese Intervention beinhaltet das Vorrücken eines Ballonkatheters an die Stelle der Plaque, und das Aufblasen des Ballons, um die Plaque auf die arterielle Wand zu komprimieren, die Die Luminalfläche zu verbreitern. Dieses Verfahren schadet jedoch der Arterie und initiiert die arterielleVerletzungsreaktion 3. Eine längere Aktivierung dieser Verletzungsreaktion führt zu arterieller Resetnose oder Re-Verengung, sekundär zu neointimer Hyperplasie und Gefäßumbau. Während der Angioplastie wird die Intimschicht von Endothelzellen denudiert, was zu einer sofortigen Thrombozytenrekrutierung und lokalen Entzündungen führt. Lokale Signalisierung induziert phänotypische Veränderungen in vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC) und adventlichen Fibroblasten. Dies führt zur Migration und Verbreitung von VSMC und Fibroblasten nach innen zum Lumen, was zu neointimer Hyperplasie4,5führt. Zirkulierende Vorläuferzellen und Immunzellen tragen ebenfalls zum Gesamtvolumen der Restenose6bei. Gegebenenfalls sind drogeneluierende Stents (DES) der aktuelle Standard zur Hemmung der Restenose7. DES hemmt jedoch eine arterielle Reendothelisierung und schafft so eine prothrombotische Umgebung, die zu einer späten In-Stent-Thrombose führen kann8. Daher sind Tiermodelle sowohl für das Verständnis der Pathophysiologie der Restenose als auch für die Entwicklung besserer therapeutischer Strategien zur Verlängerung der Wirksamkeit von Revaskularisationsverfahren von wesentlicher Bedeutung.
Mehrere große und kleine Tiermodelle9 werden für das Studium dieser Pathologie verwendet. Dazu gehören Ballon-Verletzung3,10 oder Draht-Verletzung11 der luminalen Seite einer Arterie, sowie Teilligation12 oder Manschettenplatzierung13 um die Arterie. Die Ballon- und Drahtverletzung verleugnen die Endothelschicht der Arterie und imitieren, was klinisch nach der Angioplastie geschieht. Insbesondere verwenden Ballonverletzungsmodelle ähnliche Werkzeuge wie im klinischen Umfeld (d. h. Ballonkatheter). Die Ballonverletzung wird am besten in Rattenmodellen durchgeführt, da Rattenarterien eine geeignete Größe für handelsübliche Ballonkatheter sind. Hierin beschreiben wir eine druckgesteuerte segmentale Arterienverletzung, eine etablierte, modifizierte Version der Rattenkarotisarterienballonverletzung. Dieser druckgesteuerte Ansatz imitiert das klinische Angioplastieverfahren und ermöglicht eine reproduzierbare neointimale Hyperplasiebildung zwei Wochen nach Derverletzung14,15. Darüber hinaus führt diese druckgesteuerte arterielle Verletzung zu einer vollständigen Endothelschichtwiederherstellung um 2 Wochen nach der Operation16. Dies steht direkt im Gegensatz zum ursprünglichen Ballonverletzungsmodell, das von Clowes beschrieben wird, wo die Endothelschicht nie wieder vollständig abgedeckt wird3.
Nach der Operation können Therapeutika auf die verletzte Arterie durch mehrere Ansätze angewendet oder auf sie gerichtet werden. Das hier beschriebene Verfahren verwendet die periadventitelle Anwendung eines kleinen Moleküls, das in eine Pluronic-Gellösung eingebettet ist. Insbesondere wenden wir eine Lösung von 100 ‘M cinnamic aldehyd in 25% Pluronic-F127 Gel auf die Arterie unmittelbar nach der Verletzung an, um die neointimale Hyperplasiebildung zu hemmen15. Pluronic-F127 ist ein ungiftiges, thermoreversibles Gel, das in der Lage ist, Medikamente lokal kontrolliert zu liefern17. In der Zwischenzeit ist die arterielle Verletzung lokal, daher ermöglicht die lokale Verwaltung das Testen eines Aktivenprinzips bei gleichzeitiger Minimierung von Off-Target-Effekten. Dennoch hängt die effektive Abgabe eines Therapeuten mit dieser Methode von der Chemie des verwendeten kleinen Moleküls oder biologischen Materials ab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ratten-Carotis-Arterie Ballonverletzung ist eine der am häufigsten verwendeten und untersuchten Restenose-Tiermodelle. Sowohl das ursprüngliche Ballonverletzungsmodell3 als auch die modifizierte druckgesteuerte Segmentverletzungsvariante10 haben viele Aspekte der arteriellen Verletzungsreaktion, die auch beim Menschen auftritt, informiert, wobei die wenigen Einschränkungen darin bestehen, dass sich fibrinreicher Thrombus selten entwickelt und lokale Entzündungen im …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.E.B. wurde durch ein Ausbildungsstipendium des National Institute of Environmental Health Sciences (5T32ES007126-35, 2018) und ein Vordoktorandenstipendium der American Heart Association (20PRE35120321) unterstützt. E.S.M.B. war ein KL2-Stipendiat, der teilweise vom UNC Clinical and Translational Science Award-K12 Scholars Program (KL2TR002490, 2018) und dem National Heart, Lung and Blood Institute (K01HL145354) unterstützt wurde. Die Autoren danken Dr. Pablo Ariel vom UNC Microscopy Services Laboratory für die Unterstützung bei LSFM. Die Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie wurde im Mikroskopie-Service-Labor durchgeführt. Das Mikroskopie-Services-Labor, Abteilung für Pathologie und Labormedizin, wird zum Teil durch P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant für das UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center unterstützt.
Materials
| 1 mL Syringe | Fisher | 14955450 | |
| 1 mL Syringe with needle | BD | 309626 | |
| 2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter | Edwards LifeSciences | 120602F | |
| 4-0 Ethilon (Nylon) Suture | Ethicon Inc | 662H | |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon Inc | J214H | |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Inc | 8800H | |
| 70% ethyl alcohol | |||
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21245 | |
| Atropine Sulfate | Vedco Inc | for veterinary use | |
| Cotton Swabs | Puritan | 806-WC | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Gauze | Covidien | 2252 | |
| IHC-Tek Diluent (pH 7.4) | IHC World | IW-1000 | |
| Insufflator | Merit Medical | IN4130 | |
| Iodine solution | |||
| Lubricating Eye Ointment | Dechra | for veterinary use | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Pluronic-127 (diluted in sterile water) | Sigma-Aldrich | P2443 | 25% prepared |
| Rabbit Anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Retractor | Bent paper clips work well | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc | for veterinary use | |
| Saline solution | |||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Sterile Drape | Dynarex | 4410 | |
| T-Pins |
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