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Biology

단극성 미토틱 스핀들에서 디스크 현미경 검사법에 의한 미세소관 역학 측정

Published: November 15, 2019
doi:
10.3791/60478
,
1AG Oncophysiology,Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

여기에서 우리는 살아있는 세포 회전 디스크 공초점 현미경 검사법 및 MATLAB 기지를 둔 심상 처리를 사용하여 prometaphase에서 동기화된 세포에 있는 microtubule 역학 분석의 강력하고 상세한 방법을 제시합니다.

Abstract

우리는 살아있는 세포에 있는 microtubule 역학을 결정하기 위하여 확립된 방법의 수정을 기술합니다. 이 프로토콜은 마이크로소관(tdTomato 형광 단백질로 표시된 EB3)의 양성 말단과 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 고속, 고해상도, 라이브 셀 이미징에 대한 유전자 부호 인코딩 된 마커의 발현을 기반으로합니다. 세포 주기 동기화 및 미세소관의 증가 된 밀도는 유사분열 세포에서 중추 분리를 억제함으로써 달성되며, 성장 분석은 오픈 소스 U-Track 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 밝고 적색 이동형 형광 단백질을 사용하여 낮은 레이저 파워와 함께 디스크 현미경 검사법에 필요한 노출 시간을 줄여 광독성과 빛으로 인한 유물의 확률을 감소시입니다. 이것은 표준 배양 조건의 성장 배지에서 세포를 유지하면서 동일한 제제에서 더 많은 수의 세포를 이미징할 수 있게 한다. 분석은 감독된 자동 방식으로 수행되므로 통계적으로 강력하고 재현 가능한 결과를 제공합니다.

Introduction

미세소관 (MTs)은 거의 모든 진핵 세포와 일부 박테리아1에서발견되는 매우 역동적 인 구조입니다. 액틴 및 중간 필라멘트와 함께 세포 골격2,3을조각합니다. 세포 분열4,분자 수송5,6을치는 편모, 1 차 실륨7,청각 (kinocilium)8,9,배아 발생10,11,12,침략 및 전이13,14,심지어 기억 형성15,16,17,18, 그리고 다른 많은 프로세스는 주로 MTs에 의존. 이러한 모든 이벤트에 있는 MTs의 참여는 급속하게 성장 (중합) 및 수축 (탈중합) 사이를 전환하는 그들의 놀라운 능력 없이는 불가능할 것입니다. 이 속성은 동적불안정성 19로설명됩니다. MT 역학은 많은 병리학 적 조건20,21,22에서변경됩니다. 따라서이 속성의 특성을 결정하는 것은 질병 메커니즘과 그 후의 치료를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

MT 역학 분석을 위한 방법의 긴 목록은, 대부분은 화상 진찰 기술23에근거를 둔 개발되었습니다. 초기에, 넓은 필드 광 현미경은 시험관 내 의 tubulin 중합체의 형성을 관찰하기 위해 사용되었다24. MT 플러스 엔드에서 수집되는 단자 결합(EB)-단백질의 발견과 형광성 단백질을 표지하는 방법의 개발은 넓은 필드 및 공초점 형광 현미경25,26,27를가진 살아있는 세포에서 직접 MT의 거동을 관찰할 수 있게 하였다. EB-단백질 1개(EB3)는 말단결합 단백질 3(EB3)28; 형광 단백질에 융합된 EB3를 과발현 및 추적함으로써, MT 플러스 엔드 조립속도는 29,30으로결정될 수 있다.

공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 검사법(CLSM)은 MT 역학을 따르기 위해 자주 사용됩니다. 그러나, 이 화상 진찰 기술은 광독성 및 광표백의 고위험, 살아있는 세포 및 희미한 견본 화상 진찰을 위한 2개의 바람직하지 않은 프로세스를 포즈31. 더 나은 신호 대 잡음 비를 얻으려면 레이저 전력과 노출 기간이 충분히 높아야하며 샘플을 손상시키지 않아야하며 속도를 대가로 해상도를 희생해야합니다. CLSM에 적합한 대안은 디스크현미경(32)을회전하는 것입니다. 이 이미징 양식은 핀홀배열을 포함하는 움직이는 디스크로 구성된 Nipkow디스크(33)의사용을 기반으로 하며, 동일한 샘플을 동시에34개시료를 이미징하는 많은 CLS 현미경과 동등하게 작동한다. 따라서 레이저의 빛은 시료의 여러 영역을 동시에 비추지만 공초점 특성을 유지합니다. 따라서 Nipkow 디스크를 사용하면 CLSM과 유사하지만 더 빠르고 레이저 전력을 적게 사용하여 이미지를 얻을 수 있습니다. Nipkow 디스크는 요코가와 일렉트릭에 의해 더욱 개선되었으며, 각 핀홀에 개별적으로 빛을 직접 전달하는 마이크로 렌즈 배열이있는 두 번째 디스크를 도입하여 광독성및 광 표백35를더욱 감소시켰습니다. 따라서, 회전 디스크 레이저 스캐닝 현미경 은 라이브 셀 이미징을위한 선택의 방법이되었고, 고속31,36에서높은 신호 대 잡음 비로 이미지를 얻을 수있게하며, 이는 빠르게 성장하는 MT 끝에서와 같은 신호를 해결하는 데 중요합니다.

MT 역학은 일시적으로 다릅니다. 예를 들어, 유사분열 MT는37,38. 유사하게, 유사하게, 유사하게, 유사하게, 유사하게, 유사하게 증가율 및 수축의 차이는 유사분열39,40과같은 동일한 세포 주기 단계 내에서도 관찰되었다. 따라서 잘못된 데이터 수집을 방지하기 위해 MT 역학의 측정은 셀 주기 동안 좁은 시간 창으로 제한되어야 합니다. 예를 들어, 프로메타상에서의 MT 역학의 측정은 모터 키네신 Eg541을 억제하고 양극성 유사분열스핀들(42)의형성을 방지하는 모나스트랄 유사체인 디메틸레나스트론(DME)으로 세포를 처리함으로써 달성될 수 있다. Eg5 억제제 DME 및 다른 모나스트랄 유도체와 함께 프로메타상에서 세포의 억제는 MT 역학43,44,45에영향을 미치지 않으며, 이는 DME를 고정 및 살아있는 세포 모두에서 MT 역학을 연구하는 데 유용한도구(44)로만든다.

여기에서 우리는 Ertych 등44에 의해 기술된 prometaphase 세포에 있는 MT 역학 분석의 방법을 이중 회전 디스크 화상 진찰을 결합합니다. 이 방법을 사용하면 광표백과 최소한의 광독성 없이 단일 초점 평면에서 수집된 전미상 세포에서 MT 역학을 측정할 수 있습니다. 또한, 형광 리포터로서, 녹색 형광 단백질(EGFP)에 비해 밝기와 광안정성을 향상시키고 저에너지라이트(46)로흥분하는 탠덤 디머 토마토 형광 단백질(tdTomato)을 사용합니다. 따라서 tdTomato는 여기를 위해 레이저 전력을 덜 필요로하며 광독성이 적습니다. MT 역학 분석에 필요한 광독성을 줄이고 분해능 및 후처리를 개선하여 방법을 더욱 개선합니다. 또한 다른 동기화 기술과 결합하여 메서드를 향후 수정할 수 있는 기반을 만듭니다.

Protocol

1. 헬라 세포의 파종 인산완식염수(PBS)에 5 μg/mL 섬유넥틴 용액 2mL를 준비하고 4개의 잘 챔버된 커버슬립(#1.5)의 각 우물에 450 μL을 추가합니다. 슬라이드를 37 °C 및 5 %CO2에서15 분 동안 배양합니다. 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)로 비동기적으로 성장하는 헬라 세포를 헹구고 트립신-EDTA(0.05%: 0.02%,w:v)로 배양하여 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 로스웰 공원 기념 연구소의 추가…

Representative Results

도 1A에설명된 주어진 프로토콜에 따라, pEB3-tdTomato 플라스미드는 비동기적으로 성장하는 HeLa 세포에서 일시적으로 발현되었다. 세포는 DME 처리를 통해 프로메타상에서 형질전환 후 48시간 동기화되었다(도1B). 이 단계는 MT 역학의 측정이 항상 세포 주기의 동일한 단계에서 수행되었다는 것을 보장했습니다. 타임랩스 동영상은 보충 문서<sup class=…

Discussion

여기서, 우리는 Ertych 등44에의해 처음 설립 된 방법의 수정을 설명합니다. 몇 가지 다른 수정과 함께, 우리는 이중 회전 디스크 공초점 이미징MT 역학 분석의이 기술을 결합합니다. 듀얼 스피닝 디스크를 사용하면 증가하는 MT의 해상도를 향상시키는 동시에 광독성36을줄입니다. 우리는 더 긴 파장 형광 리포터로 전환하여 광 표백 및 레이저 광 유도 세포의 손상?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 그들의 전문가 적인 조언 및 지원에 대한 빛 현미경 검사시설, 실험 의학의 막스 플랑크 연구소의 회원들에게 감사드립니다.

Materials

Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software
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Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).
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