Здесь мы представляем надежный и подробный метод анализа микротрубной динамики в клетках, синхронизированных в прометафазе с помощью живой клетки вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и обработки изображений на основе MATLAB.
Мы описываем модификацию установленного метода определения динамики микротрубв в живых клетках. Протокол основан на экспрессии генетически закодированного маркера для положительных концов микротрубок (EB3, маркированных флуоресцентным белком tdTomato) и высокоскоростной, с высоким разрешением, живоклеточной визуализации с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Синхронизация клеточного цикла и увеличение плотности микротрубок достигается путем ингибирования центросомального разделения в митотических клетках, а анализ роста проводится с помощью программного обеспечения U-Track с открытым исходным кодом. Использование яркого и красного сдвига флуоресцентного белка в сочетании с более низкой мощностью лазера и сокращением времени экспозиции, необходимого для вращающейся дисковой микроскопии, снижает фототоксичность и вероятность световых артефактов. Это позволяет для визуализации большего количества клеток в том же препарате при сохранении клеток в среде роста в стандартных условиях культуры. Поскольку анализ выполняется контролируемым автоматическим способом, результаты являются статистически надежными и воспроизводимыми.
Микротрубочки (МТ) являются высокодинамическими структурами, встречаемыми практически во всех эукариотических клетках и в некоторых бактериях1. Вместе с актином и промежуточными нитями они лепят цитоскелет2,3. Ячейка разделение4, молекула транспорт5, flagellar избиение6, ощущение окружающей среды через первичный цилиум7, слух (киноцилиум)8,9, эмбриогенез10,11,12, вторжение и метастазы13,14, и даже формирование памяти15,16,17,18, и многие другие процессы в первую очередь опираются на МТ. Участие МТ во всех этих событиях было бы невозможно без их замечательной способности быстро переключаться между ростом (полимеризация) и усадки (деполимеризация). Это свойство описывается как динамическая нестабильность19. Mt динамика изменяется во многих патологических условиях20,21,22. Таким образом, определение характера этого свойства может помочь понять механизмы болезни, а затем их лечение.
Для анализа динамики МТ был разработан длинный список методов, большинство из которых основаны на методах визуализации23. Первоначально для наблюдения за образованием полимеров тубулина в пробирке24использовались широкоугольные световые микроскопы. Открытие конечных связывания (EB)-белки, которые собирают на МТ плюс-концы и развитие методов флуоресцентно этикетки белков позволило наблюдать за поведением MTs непосредственно в живых клетках с широким полем и конфокальные флуоресценции микроскопов25,26,27. Один EB-белок является конечным связывающим белком 3 (EB3)28; путем переэкспрессинга и отслеживания EB3, слитого в флуоресцентный белок, MT плюс конец сборки ставки могут быть определены29,30.
Конфокальная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия (CLSM) часто используется для наблюдения за динамикой МТ. Тем не менее, этот метод визуализации представляет высокий риск фототоксичности и фотоотбеления, два нежелательных процессов для живых клеток и тусклый образец изображения31. Для того, чтобы получить лучшее соотношение сигнала к шуму, мощность лазера и продолжительность экспозиции должны быть достаточно высокими, не повреждая образцы, и это требует ущерба разрешением в обмен на скорость. Подходящей альтернативой CLSM является спиннинг дискмикроскопия32. Эта модальность изображения основана на использовании диска Nipkow33, который состоит из движущегося диска, несущего массив пинхолов, и работает эквивалентно многим микроскопам CLS, изображая тот же образец одновременно34. Таким образом, свет от лазера будет освещать несколько областей в образце одновременно, но сохранить конфокальный характер. Таким образом, диск Nipkow позволяет получать изображения, похожие на CLSM, но быстрее и используя меньше лазерной энергии. Диск Nipkow был дополнительно улучшен Yokogawa Electric, который представил второй диск с массивом микролинз на нем, что индивидуально направлять свет в соответствующую пинхол, дальнейшее снижение фототоксичности и photobleaching35. Таким образом, вращающийся диск лазерное сканирование микроскопии стал методом выбора для живой визуализации клеток, и это позволяет получать изображения с высоким соотношением сигнала к шуму на высокой скорости31,36, что имеет решающее значение для решения сигналов, таких как от быстрорастущих концов МТ.
Динамика МТ временно отличается. Например, митотические МТ более динамичны, чем межфазные37,38. Аналогичным образом, различия в темпах роста и усадке наблюдались даже в пределах одной и той же фазы клеточного цикла, например, митоза39,40. Поэтому, чтобы избежать ложного сбора данных, измерение динамики МТ должно ограничиваться узким временем во время клеточного цикла. Например, измерение динамики МТ в прометафазе может быть достигнуто путем лечения клеток с диметиленастроном (DME), монострольным аналогом, который подавляет моторный кинезин Eg541 и предотвращает образование биполярного митоtic шпинделя42. Ингибирование клеток на прометафазе с ингибитором Eg5 DME и другими производными монастрола не влияет на динамику МТ43,44,45, что делает DME полезным инструментом для изучения динамики МТ как в стационарных, так и в живых клетках44.
Здесь мы объединяем метод анализа динамики МТ в прометафазных клетках, описанных Ertych et al.44, с двойной вращающейся визуализацией диска. Этот метод позволяет измерять динамику МТ в прометафазных клетках, собранных из одного фокусного плана с более высокой частотой изображений, но без фотоотбелевания и минимальной фототоксичности. Кроме того, как флуоресцентный репортер, мы используем тандем димер томатный флуоресцентный белок (tdTomato), который улучшил яркость и фотостабильность по сравнению с зеленым флуоресцентным белком (EGFP) и возбуждается с более низким энергетическим светом46. Таким образом, tdTomato требует меньше лазерной энергии для возбуждения и менее фототоксичным. В целом, мы дополнительно улучшаем метод за счет снижения фототоксичности и улучшения разрешения и постобработки, необходимых для анализа динамики Mt. Кроме того, мы создаем основу для будущих модификаций метода, объединив его с другими методами синхронизации.
Здесь мы описываем модификацию метода, впервые установленного Ertych et al.44. Наряду с несколькими другими модификациями, мы сочетаем эту технику анализа динамики МТ с двойной вращающейся дискковой конфокальной визуализации. Использование двойного вращающегося диска улучшае?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов Фонда световой микроскопии, Института экспериментальной медицины Макса-Планка, за их экспертные советы и поддержку.
Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
DPBS | Gibco | 14190-094 | |
Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium |
µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100XC Oil |
ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm | |
Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier | |
HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |