Измерение динамики микротрубок с помощью вращающейся микроскопии диска в монополярных митотическом спинное

Summary

Здесь мы представляем надежный и подробный метод анализа микротрубной динамики в клетках, синхронизированных в прометафазе с помощью живой клетки вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и обработки изображений на основе MATLAB.

Abstract

Мы описываем модификацию установленного метода определения динамики микротрубв в живых клетках. Протокол основан на экспрессии генетически закодированного маркера для положительных концов микротрубок (EB3, маркированных флуоресцентным белком tdTomato) и высокоскоростной, с высоким разрешением, живоклеточной визуализации с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Синхронизация клеточного цикла и увеличение плотности микротрубок достигается путем ингибирования центросомального разделения в митотических клетках, а анализ роста проводится с помощью программного обеспечения U-Track с открытым исходным кодом. Использование яркого и красного сдвига флуоресцентного белка в сочетании с более низкой мощностью лазера и сокращением времени экспозиции, необходимого для вращающейся дисковой микроскопии, снижает фототоксичность и вероятность световых артефактов. Это позволяет для визуализации большего количества клеток в том же препарате при сохранении клеток в среде роста в стандартных условиях культуры. Поскольку анализ выполняется контролируемым автоматическим способом, результаты являются статистически надежными и воспроизводимыми.

Introduction

Микротрубочки (МТ) являются высокодинамическими структурами, встречаемыми практически во всех эукариотических клетках и в некоторых бактериях^1. Вместе с актином и промежуточными нитями они лепят цитоскелет^2,3. Ячейка разделение⁴, молекула транспорт⁵, flagellar избиение⁶, ощущение окружающей среды через первичный цилиум⁷, слух (киноцилиум)^8,9, эмбриогенез^10,11,12, вторжение и метастазы^13,14, и даже формирование памяти^15,16,17,18, и многие другие процессы в первую очередь опираются на МТ. Участие МТ во всех этих событиях было бы невозможно без их замечательной способности быстро переключаться между ростом (полимеризация) и усадки (деполимеризация). Это свойство описывается как динамическая нестабильность¹⁹. Mt динамика изменяется во многих патологических условиях^20,21,22. Таким образом, определение характера этого свойства может помочь понять механизмы болезни, а затем их лечение.

Для анализа динамики МТ был разработан длинный список методов, большинство из которых основаны на методах визуализации^23. Первоначально для наблюдения за образованием полимеров тубулина в пробирке²⁴использовались широкоугольные световые микроскопы. Открытие конечных связывания (EB)-белки, которые собирают на МТ плюс-концы и развитие методов флуоресцентно этикетки белков позволило наблюдать за поведением MTs непосредственно в живых клетках с широким полем и конфокальные флуоресценции микроскопов^25,26,27. Один EB-белок является конечным связывающим белком 3 (EB3)^28; путем переэкспрессинга и отслеживания EB3, слитого в флуоресцентный белок, MT плюс конец сборки ставки могут быть определены^29,30.

Конфокальная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия (CLSM) часто используется для наблюдения за динамикой МТ. Тем не менее, этот метод визуализации представляет высокий риск фототоксичности и фотоотбеления, два нежелательных процессов для живых клеток и тусклый образец изображения³¹. Для того, чтобы получить лучшее соотношение сигнала к шуму, мощность лазера и продолжительность экспозиции должны быть достаточно высокими, не повреждая образцы, и это требует ущерба разрешением в обмен на скорость. Подходящей альтернативой CLSM является спиннинг дискмикроскопия³². Эта модальность изображения основана на использовании диска Nipkow³³, который состоит из движущегося диска, несущего массив пинхолов, и работает эквивалентно многим микроскопам CLS, изображая тот же образец одновременно³⁴. Таким образом, свет от лазера будет освещать несколько областей в образце одновременно, но сохранить конфокальный характер. Таким образом, диск Nipkow позволяет получать изображения, похожие на CLSM, но быстрее и используя меньше лазерной энергии. Диск Nipkow был дополнительно улучшен Yokogawa Electric, который представил второй диск с массивом микролинз на нем, что индивидуально направлять свет в соответствующую пинхол, дальнейшее снижение фототоксичности и photobleaching³⁵. Таким образом, вращающийся диск лазерное сканирование микроскопии стал методом выбора для живой визуализации клеток, и это позволяет получать изображения с высоким соотношением сигнала к шуму на высокой скорости^31,36, что имеет решающее значение для решения сигналов, таких как от быстрорастущих концов МТ.

Динамика МТ временно отличается. Например, митотические МТ более динамичны, чем межфазные^37,38. Аналогичным образом, различия в темпах роста и усадке наблюдались даже в пределах одной и той же фазы клеточного цикла, например, митоза^39,40. Поэтому, чтобы избежать ложного сбора данных, измерение динамики МТ должно ограничиваться узким временем во время клеточного цикла. Например, измерение динамики МТ в прометафазе может быть достигнуто путем лечения клеток с диметиленастроном (DME), монострольным аналогом, который подавляет моторный кинезин Eg5⁴¹ и предотвращает образование биполярного митоtic шпинделя^42. Ингибирование клеток на прометафазе с ингибитором Eg5 DME и другими производными монастрола не влияет на динамику МТ^43,44,45, что делает DME полезным инструментом для изучения динамики МТ как в стационарных, так и в живых клетках⁴⁴.

Здесь мы объединяем метод анализа динамики МТ в прометафазных клетках, описанных Ertych et al.^44, с двойной вращающейся визуализацией диска. Этот метод позволяет измерять динамику МТ в прометафазных клетках, собранных из одного фокусного плана с более высокой частотой изображений, но без фотоотбелевания и минимальной фототоксичности. Кроме того, как флуоресцентный репортер, мы используем тандем димер томатный флуоресцентный белок (tdTomato), который улучшил яркость и фотостабильность по сравнению с зеленым флуоресцентным белком (EGFP) и возбуждается с более низким энергетическим светом⁴⁶. Таким образом, tdTomato требует меньше лазерной энергии для возбуждения и менее фототоксичным. В целом, мы дополнительно улучшаем метод за счет снижения фототоксичности и улучшения разрешения и постобработки, необходимых для анализа динамики Mt. Кроме того, мы создаем основу для будущих модификаций метода, объединив его с другими методами синхронизации.

Protocol

1. Посев клеток HeLa Приготовьте 2 мл 5 мл/мл фибронектина раствор афериста (PBS) и добавьте 450 л его в каждую скважину 4 хорошо камерного покрытия (#1,5). Инкубировать слайд в течение 15 мин при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. Промыть асинхронно растущие клетки HeLa с фосфатным солей Dulbec…

Representative Results

Следуя данному протоколу, изложенному на рисунке 1A,плазмида pEB3-tdTomato была транслеэффектно выражена в асинхронно растущих клетках HeLa. Клетки были синхронизированы 48 ч после трансфекции на прометафазе через лечение DME(рисунок 1B). Этот шаг обеспечил, чтобы и…

Discussion

Здесь мы описываем модификацию метода, впервые установленного Ertych et al.⁴⁴. Наряду с несколькими другими модификациями, мы сочетаем эту технику анализа динамики МТ с двойной вращающейся дискковой конфокальной визуализации. Использование двойного вращающегося диска улучшае?…

Materials

Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software