मंजूरी दे दी दिल तीन आयामी इमेजिंग के माध्यम से लक्षित सेल आबादी के हृदय चोट प्रतिक्रिया पर कब्जा
Summary
चोट के बाद कार्डियोमायोसाइट प्रसार एक गतिशील प्रक्रिया है जिसके लिए गैर-मायोसाइट सेल आबादी से बाह्य संकेतों की सिम्फनी की आवश्यकता होती है। वंश ट्रेसिंग, निष्क्रिय स्पष्टता, और त्रि-आयामी पूरे-माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करते हुए, हम हृदय की मरम्मत और उत्थान पर विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों के प्रभाव का विश्लेषण कर सकते हैं।
Abstract
हृदय रोग मौत के अन्य सभी कारणों को मात देता है और दुनिया भर में मृत्यु का एक चौंका देने वाला 31% के लिए जिम्मेदार है। यह बीमारी हृदय की चोट में प्रकट होती है, मुख्य रूप से एक तीव्र मायोकार्डियल इंफेक्शन के रूप में। चोट के बाद थोड़ा लचीलापन के साथ, एक बार स्वस्थ हृदय ऊतक रेशेदार, गैर संकुचन निशान ऊतक द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा और अक्सर दिल की विफलता के लिए एक प्रस्तावना हो । पुनर्योजी चिकित्सा में उपन्यास उपचार विकल्पों की पहचान करने के लिए, अनुसंधान ने जन्मजात पुनर्योजी क्षमताओं के साथ कशेरुकी पर ध्यान केंद्रित किया है। ऐसा ही एक आदर्श जीव नवजात माउस है, जो मजबूत मायोकार्डियल पुनर्जनन के साथ हृदय की चोट का जवाब देता है। नवजात माउस में चोट को प्रेरित करने के लिए जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक है, हमने मानव हृदय में एथेरोस्क्लेरोसिस द्वारा शुरू किए गए एक मायोकार्डियल इंफेक्शन को प्रतिबिंबित करते हुए बाएं पूर्वकाल उतरते धमनी (एलएडी) को कम करने के लिए एक सर्जरी विकसित की है। जब कार्डियोमायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट आबादी दोनों के भीतर परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए प्रौद्योगिकी के साथ मिलान किया जाता है, तो यह मॉडल हमें हृदय उत्थान का मार्गदर्शन करने वाले तंत्रों की पहचान करने के लिए एक मंच प्रदान करता है। चोट के बाद हृदय कोशिका आबादी में परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करना एक बार ऊतक अनुभागन और हिस्टोलॉजिकल परीक्षा जैसे तरीकों पर भारी भरोसा करता था, जो दो आयामी विश्लेषण तक सीमित होते हैं और अक्सर इस प्रक्रिया में ऊतक को नुकसान पहुंचाते हैं। इसके अलावा, इन तरीकों में सेल वंश में परिवर्तन का पता लगाने की क्षमता की कमी है, बजाय केवल चोट प्रतिक्रिया का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। यहां, हम वर्णन करते हैं कि कार्डियक रिपेयर के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए वंश ट्रेसिंग मॉडल, पूरे अंग समाशोधन और त्रि-आयामी (3 डी) पूरी माउंट माइक्रोस्कोपी में तकनीकी रूप से उन्नत तरीकों का उपयोग कैसे किया जा सकता है। नवजात माउस मायोकार्डियल इंफेक्शन सर्जरी, ऊतक समाशोधन, और 3 डी पूरे अंग इमेजिंग के लिए हमारे प्रोटोकॉल के साथ, कार्डियोमायोसाइट प्रसार को प्रेरित करने वाले जटिल रास्ते सुलझाया जा सकता है, हृदय उत्थान के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों का खुलासा।
Introduction
दिल लंबे समय से एक के बाद माइटोटिक अंग माना जाता है, अभी तक हाल ही में सबूत दर्शाता है कि कार्डियोमायोसाइट नवीकरण वयस्क मानव दिल में प्रति वर्ष1%के बारे में होता है । हालांकि, कार्डियोमायोसाइट कारोबार की ये कम दरें चोट के बाद होने वाले ऊतकों के भारी नुकसान की भरपाई करने के लिए अपर्याप्त हैं। एक दिल है कि एक मायोकार्डियल इंफेक्शन का सामना करना पड़ा है लगभग एक अरब कार्डियोमायोसाइट्स खो देंगे, अक्सर दिल की विफलता और अचानक हृदय मृत्यु2,,3के लिए एक प्रस्तावना के रूप में सेवारत । दुनिया भर में दिल की विफलता से प्रभावित २६,०००,००० से अधिक लोगों के साथ, चिकित्सीय चिकित्सा के लिए एक अपूरित जरूरत है कि हृदय रोग4द्वारा दिए गए नुकसान रिवर्स कर सकते हैं ।
चिकित्सा विज्ञान में इस अंतर को पाटने के लिए, वैज्ञानिकों ने विकासवादी रूप से संरक्षित तंत्रों की जांच शुरू कर दी है जो चोट के बाद एंडोजेनस पुनर्जनन को रेखांकित करते हैं । स्तनधारी हृदय उत्थान का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल नवजात माउस है। जन्म के बाद सप्ताह के भीतर, नवजात चूहों हृदय क्षति5के बाद एक मजबूत पुनर्योजी प्रतिक्रिया है । हमने पहले यह दर्शाया है कि नवजात चूहे एक एपिकल रिसेक्शन5के बाद कार्डियोमायोसाइट प्रसार के माध्यम से अपने दिल को पुनर्जीवित कर सकते हैं। हालांकि इस तकनीक नवजात णों में हृदय उत्थान पैदा कर सकते हैं, सर्जरी मानव दिल की चोटों के लिए नैदानिक प्रासंगिकता का अभाव है । नवजात माउस मॉडल में मानव चोट की नकल करने के लिए, हमने कोरोनरी धमनी ऑक्सीलेशन6के माध्यम से एक मायोकार्डियल इंफेक्शन को प्रेरित करने की तकनीक विकसित की है। इस तकनीक में बाएं पूर्वकाल उतरते धमनी (एलएडी) के सर्जिकल लिगेशन की आवश्यकता होती है, जो 40% -50% रक्त को बाएं वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम6,,7तक पहुंचाने के लिए जिम्मेदार है। इस प्रकार, सर्जरी के परिणामस्वरूप एक इंफर्ट होता है जो बाईं वेंट्रिकुलर दीवार के एक महत्वपूर्ण हिस्से को प्रभावित करता है। मायोकार्डियम को होने वाले नुकसान से नवजात5में कार्डियोमायोसाइट प्रसार और हृदय उत्थान को बढ़ावा मिलेगा ।
कोरोनरी धमनी ऑक्सीलेशन सर्जरी हृदय उत्थान के आंतरिक कामकाज को उजागर करने के लिए एक अत्यधिक प्रजनन योग्य और सीधे अनुवाद विधि प्रदान करती है। नवजात सर्जरी मानव हृदय में कोरोनरी धमनी एथेरोस्क्लेरोसिस समानताएं, जहां धमनियों की भीतरी दीवारों के भीतर पट्टिका का संचय एक occlusion और बाद में मायोकार्डियल इंफेक्शन8पैदा कर सकता है । दिल की विफलता के रोगियों के लिए चिकित्सीय उपचार में एक शूंय के कारण, बालक में एक occlusion मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है एक साल के भीतर 26% तक पहुंचने के लिएचोट 9के बाद, और फलस्वरूप “विधवा निर्माता कहा गया है.” चिकित्सा विज्ञान में प्रगति के लिए एक मॉडल की आवश्यकता होती है जो हृदय की चोट के जटिल शारीरिक और रोग प्रभावों को सटीक रूप से दर्शाता है। नवजात माउस हृदय चोट के लिए हमारा सर्जिकल प्रोटोकॉल एक मंच प्रदान करता है जो शोधकर्ताओं को आणविक और सेलुलर संकेतों की जांच करने की अनुमति देता है जो चोट के बाद स्तनधारी हृदय उत्थान का संकेत देते हैं।
हाल के शोध में बाह्य वातावरण और कार्डियोमायोसाइट्स के बीच गतिशील संबंध पर प्रकाश डाला गया है। उदाहरण के लिए, प्रसवोत्तर पुनर्योजी खिड़की को हृदय10के आसपास के बाह्य मैट्रिक्स की कठोरता को कम करके बढ़ाया जा सकता है। नवजात बाह्युशिकी मैट्रिक्स से बायोमैटेरियल्स हृदय की चोट11के बाद वयस्क स्तनधारी दिलों में हृदय उत्थान को भी बढ़ावा दे सकते हैं । कार्डियोमायोसाइट प्रसार के साथ एक एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया12,13है; कोलैटरल धमनी नवजन्म माउस के पुनर्जीवन दिल के लिए अद्वितीय गठन हृदय उत्थान12उत्तेजक के लिए आवश्यक होना दिखाया गया था . इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला ने दिखा दिया है कि तंत्रिका सिग्नलिंग विकास कारक स्तरों के मॉड्यूलेशन के माध्यम से कार्डियोमायोसाइट प्रसार और हृदय उत्थान को नियंत्रित करता है, साथ ही चोट14के बाद भड़काऊ प्रतिक्रिया भी देता है। ये निष्कर्ष हृदय की चोट के जवाब में गैर-मायोसाइट सेल आबादी का पता लगाने की आवश्यकता पर जोर देते हैं। इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, हमने वंश ट्रेसिंग के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन की संविलियन या सशर्त अभिव्यक्ति को शामिल करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों लाइनों में क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली का लाभ उठाया है। इसके अलावा, हम इंद्रधनुष माउस लाइन के साथ क्लोनल विस्तार पैटर्निंग निर्धारित करने के लिए उन्नत तरीकों का उपयोग कर सकते हैं, जो लक्षित सेल आबादी15के क्लोनल विस्तार को निर्धारित करने के लिए क्रे-निर्भर, बहु-रंग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं की उदासीन अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। नवजात कोरोनरी धमनी ऑक्सीलेशन सर्जरी के साथ वंश अनुरेखण को नियोजित करना हृदय उत्थान के जटिल सेलुलर तंत्र को विच्छेदन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
तीन आयामी (3 डी) पूरे अंग इमेजिंग के साथ फ्लोरोसेंटी लेबल कोशिकाओं के वंश पर नज़र रखने के लिए पारंपरिक अनुभागऔर पुनर्निर्माण तकनीक का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए मुश्किल है-खासकर जब सेल आबादी नाजुक हैं, जैसे तंत्रिका फाइबर या रक्त वाहिकाओं । जबकि ऑप्टिकल सेक्शनिंग द्वारा अंग की प्रत्यक्ष संपूर्ण-माउंट इमेजिंग सतही कोशिका आबादी को कैप्चर कर सकती है, ऊतक के भीतर गहरी रहने वाली संरचनाएं दुर्गम रहती हैं। इन बाधाओं को दरकिनार करने के लिए, पूरे अंग ऊतकों की अस्पष्टता को कम करने के लिए ऊतक समाशोधन तकनीक विकसित की गई है। हाल ही में, लिपिड-एक्सचेंज एक्रिलामाइड-हाइब्रिड्ड कठोर इमेजिंग संगत ऊतक हिड्रोगेल (स्पष्टता) आधारित तरीकों को साफ करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति की गई है, जो लिपिड निष्कर्षण16के माध्यम से निश्चित ऊतक को स्पष्ट करते हैं। अपवर्तक सूचकांक को समरूप बनाने और बाद में इमेजिंग17के दौरान प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए भी कदम उठाए जाते हैं । ऐसी ही एक विधि सक्रिय स्पष्टता है, जो पूरे ऊतक18में डिटर्जेंट को भेदने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके लिपिड अपघटन को तेज करती है। हालांकि प्रभावी, इस ऊतक समाशोधन विधि महंगे उपकरणों की आवश्यकता है और ऊतक क्षति का कारण बन सकता है, इस तरह के हृदय नसों19के रूप में नाजुक सेल आबादी के साथ असंगत दृष्टिकोण बना । इस प्रकार, हम निष्क्रिय स्पष्टता दृष्टिकोण को नियोजित करते हैं, जो डिटर्जेंट प्रवेश को धीरे-धीरे सुविधाजनक बनाने के लिए गर्मी पर निर्भर करता है, इसलिए जटिल कोशिका संरचनाओं को बनाए रखने में सहायता करता है20,,21।
निष्क्रिय स्पष्टता को आम तौर पर सक्रिय स्पष्टता18की तुलना में कम कुशल माना जाता है, क्योंकि तकनीक अक्सर दो प्रमुख बाधाओं के साथ होती है: पूरे अंग गहराई को साफ करने में असमर्थता और वयस्क ऊतकों को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक समय की व्यापक मात्रा। हमारा निष्क्रिय स्पष्टता दृष्टिकोण इन दोनों बाधाओं को एक त्वरित समाशोधन प्रक्रिया के साथ दूर करता है जो नवजात और वयस्क हृदय ऊतक ों को पूरी तरह से साफ करने में सक्षम है। हमारे निष्क्रिय स्पष्टता ऊतक समाशोधन तकनीक एक दक्षता है कि हृदय सेल आबादी की एक किस्म के दृश्य की अनुमति देता है, दुर्लभ वयस्क दिल भर में वितरित आबादी सहित पहुंच गया है । जब स्पष्ट दिल को फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ चित्रित किया जाता है, तो विकास, रोग और उत्थान के दौरान सेल-विशिष्ट पैटर्निंग की वास्तुकला को प्रकाशित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कार्डियोमायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट आबादी के बीच सेल-सेल बातचीत इस बात का एक निर्धारण कारक है कि क्या दिल को चोट के बाद फाइब्रोसिस या मरम्मत से गुजरना होगा। खोजों का प्रदर्शन किया गया है कि कोशिका प्रक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के लिए वित्तपोषण यूडब्ल्यू स्कूल ऑफ मेडिसिन एंड पब्लिक हेल्थ द्वारा विस्कॉन्सिन पार्टनरशिप प्रोग्राम (एआईएम) और एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड 19CDA34660169 (A.I.M.) से प्रदान किया गया था।
Materials
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
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