Захват сердечной травмы ответ целевых популяций клеток через очищенное сердце трехмерных изображений

Summary

Пролиферация кардиомиоцитов после травмы является динамичным процессом, который требует симфонии внеклеточных сигналов от немиоцитных клеточных популяций. Используя отслеживание линий, пассивный CLARITY и трехмерные методы полной монтажной конфокальной микроскопии, мы можем анализировать влияние различных типов клеток на восстановление и регенерацию сердца.

Abstract

Сердечно-сосудистые заболевания превосходит все другие причины смерти и несет ответственность за ошеломляющие 31% смертей во всем мире. Это заболевание проявляется при сердечной травме, в первую очередь в виде острого инфаркта миокарда. С небольшой устойчивостью после травмы, когда-то здоровая сердечная ткань будет заменена волокнистой, неконтрактной рубцовой ткани и часто будет прелюдией к сердечной недостаточности. Чтобы определить новые варианты лечения в регенеративной медицине, исследования были сосредоточены на позвоночных с врожденными регенеративными возможностями. Одним из таких образцов организм неонатального мышки, которая реагирует на сердечную травму с надежной регенерацией миокарда. Для того, чтобы вызвать травму неонатальной мыши, которая является клинически актуальной, мы разработали операцию по окклюзии левой передней нисходящей артерии (LAD), отражая инфаркт миокарда, вызванный атеросклерозом в сердце человека. В сочетании с технологией отслеживания изменений как в кардиомиоцитах, так и в популяциях, не связанных с миоцитами, эта модель предоставляет нам платформу для определения механизмов, которые направляют регенерацию сердца. Получение информации об изменениях в популяциях сердечно-клеточных клеток после травмы когда-то в значительной степени опиралось на такие методы, как секция тканей и гистологическое обследование, которые ограничиваются двумерным анализом и часто повреждают ткани в процессе. Кроме того, эти методы не имеют возможности отслеживать изменения в клеточных линиях, вместо этого предоставляя лишь снимок ответа травмы. Здесь мы описываем, как технологически передовые методы в модели отслеживания линий, очистка всего органа, и трехмерной (3D) полной монтажной микроскопии могут быть использованы для выяснения механизмов восстановления сердца. С нашим протоколом для неонатальной мыши хирургии инфаркта миокарда, очистки тканей, и 3D всего органа изображения, сложные пути, которые вызывают пролиферацию кардиомиоцитов могут быть разгачены, выявление новых терапевтических целей для регенерации сердца.

Introduction

Сердце уже давно считается пост-митотическим органом, но последние данные свидетельствуют о том, что обновление кардиомиоцитов происходит во взрослом сердце человека примерно на 1% в год¹. Тем не менее, эти низкие показатели кардиомиоцитов текучести являются недостаточными для пополнения массовой потери ткани, что происходит после травмы. Сердце, которое перенес инфаркт миокарда потеряет около одного миллиарда кардиомиоцитов, часто выступающей в качестве прелюдии к сердечной недостаточности и внезапной сердечной смерти^2,3. С более чем 26 миллионов людей, пострадавших от сердечной недостаточности во всем мире, есть неудовлетворенная потребность в терапии, которые могут обратить вспять ущерб, причиненный сердечно-сосудистых заболеваний⁴.

Для того, чтобы преодолеть этот разрыв в терапии, ученые начали исследовать эволюционно сохраненные механизмы, которые лежат в основе эндогенной регенерации после травмы. Одной из моделей для изучения регенерации сердца млекопитающих является неонатальная мышь. В течение недели после рождения, неонатальный мышей имеют надежный регенеративный ответ после повреждения сердца⁵. Мы ранее показали, что неонатальные мыши могут регенерировать свое сердце через пролиферацию кардиомиоцитов после апического резекции⁵. Хотя этот метод может вызвать регенерацию сердца у новорожденных, операция не имеет клинического отношения к травмам сердца человека. Для того, чтобы имитировать травмы человека в модели неонатальной мыши, мы разработали метод, чтобы вызвать инфаркт миокарда через окклюзию коронарной артерии⁶. Этот метод требует хирургической перевязки левой передней нисходящей артерии (LAD), которая отвечает за доставку 40%-50% крови в левый желудочный миокард^6,7. Таким образом, операция приводит к инфаркту, который воздействует на значительную часть левой стенки желудочка. Это повреждение миокарда будет стимулировать пролиферацию кардиомиоцитов и регенерацию сердца у новорожденных^5.

Операция окклюзии коронарной артерии обеспечивает высоко воспроизводимый и непосредственно переводческий метод, чтобы раскрыть внутреннюю работу сердечной регенерации. Неонатальная хирургия параллели коронарного атеросклероза артерии в сердце человека, где накопление бляшек во внутренних стенках артерий может вызвать окклюзию и последующий инфаркт миокарда⁸. Из-за пустоты в терапевтических лечения для пациентов с сердечной недостаточностью, окклюзия в LAD связано с смертностью достигает до 26% в течение года после травмы⁹, и, следовательно, был назван “вдова Maker”. Достижения в области терапии требуют модели, которая точно отражает сложные физиологические и патологические последствия сердечной травмы. Наш хирургический протокол для неонатальной мыши сердечной травмы обеспечивает платформу, которая позволяет исследователям исследовать молекулярные и клеточные сигналы, которые сигнализируют регенерации сердца млекопитающих после травмы.

Недавние исследования подчеркивают динамическую взаимосвязь между внеклеточной средой и пролиферирующими кардиомиоцитами. Например, послеродовое регенеративное окно может быть расширено за счет уменьшения жесткости внеклеточной матрицы, окружающей сердце^10. Биоматериалы из неонатальной внеклеточной матрицы могут также способствовать регенерации сердца у взрослых млекопитающих сердца после сердечной травмы¹¹. Также сопровождающим пролиферацией кардиомиоцитов является ангиогенный ответ^12,,13; было показано, что образование побочных артерий, уникальное для регенерирующего сердца неонатальной мыши, имеет важное значение для стимуляции регенерации сердца^12. Кроме того, наша лаборатория показала, что сигнализация нерва регулирует пролиферацию кардиомиоцитов и регенерацию сердца через модуляцию уровней фактора роста, а также воспалительный ответ после травмы^14. Эти выводы подчеркивают необходимость отслеживания не миоцитных клеточных популяций в ответ на сердечную травму. Для достижения этой цели мы воспользовались системой рекомбинации Cre-lox в трансгенных линиях мышей, чтобы включить составные или условные выражения флуоресцентных белков репортера для отслеживания родословной. Кроме того, мы можем использовать передовые методы для определения клонального расширения шаблона с линией мыши Радуга, которая опирается на стохасическое выражение Cre-зависимых, многоцветных флуоресцентных репортеров, чтобы определить клональное расширение целевых популяций клеток¹⁵. Использование линии отслеживания с неонатальной коронарной артерии окклюзии хирургии является мощным инструментом для вскрытия сложных клеточных механизмов сердечной регенерации.

Отслеживание линии флуоресцентно маркированных клеток с трехмерной (3D) визуализацией всего органа трудно достичь с помощью традиционной секционной и восстановительных методов , особенно когда популяции клеток хрупкие, такие как нервные волокна или кровеносные сосуды. В то время как прямое изображение цельногорного органа оптическим сечением может захватывать поверхностные популяции клеток, структуры, которые находятся глубоко внутри ткани, остаются недоступными. Чтобы обойти эти барьеры, методы очистки тканей были разработаны, чтобы уменьшить непрозрачность целых тканей органов. В последнее время, значительные успехи были сделаны для ясной Липид-обменянный Акриламид-гибридизированные Rigid Imaging совместимых Ткань hYdrogel (CLARITY) на основе методов, которые очистить фиксированной ткани через липидной экстракции¹⁶. Также предпринимаются шаги по гомогенизации рефракционного индекса и последующему уменьшению рассеяния света во время визуализации¹⁷. Одним из таких методов является активный CLARITY, который ускоряет разложение липидов с помощью электрофореза, чтобы проникнуть в моющее средство по всей ткани¹⁸. Хотя этот метод очистки тканей требует дорогостоящего оборудования и может привести к повреждению тканей, что делает подход несовместимым с хрупкими популяциями клеток, такими как сердечные нервы^19. Таким образом, мы используем пассивный подход CLARITY, который опирается на тепло, чтобы мягко облегчить проникновение моющего средства, тем самым помогая в сохранении сложных клеточных структур^20,21.

Пассивный CLARITY, как правило, считается менее эффективным, чем активные CLARITY¹⁸, как техника часто сопровождается двумя основными препятствиями: неспособность очистить всю глубину органа и большое количество времени, необходимого для очистки тканей взрослых. Наш пассивный подход CLARITY преодолевает оба этих барьера с помощью ускоренного процесса очистки, который способен полностью очистить ткани сердца новорожденных и взрослых. Наша пассивная техника очистки тканей CLARITY достигла эффективности, которая позволяет визуализировать различные популяции сердечных клеток, включая редкие популяции, распределенные по всему взрослому сердцу. Когда очищенное сердце изображено с конфокальной микроскопией, архитектура клеточного узора во время развития, болезни и регенерации может быть освещена.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по использованию и уходу за лабораторными животными и в соответствии с Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Школе медицины и общественного здравоохранения Университета Висконсин-Мэдисон. Все мето…

Representative Results

Часто два самых сложных шага направляют сердце из грудной полости и ligating LAD. Для устранения неполадок эти шаги могут быть внесены коррективы при размещении первоначального прокола между четвертыми межреберными мышцами; если прокол и тупое вскрытие находятся слишком близко в непосредс…

Discussion

Клеточные взаимодействия между кардиомиоцитами и немиоцитов населения являются определяющим фактором ли сердце будет проходить фиброз или ремонт после травмы. Открытия были сделаны, демонстрируя, что различные типы клеток, в том числе нервы¹⁴, эпикардиальные клетки<sup class=…

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator