Capturer la réponse aux blessures cardiaques des populations cellulaires ciblées par l’imagerie tridimensionnelle du cœur effacé

Summary

La prolifération cardiomyocyte suivant la blessure est un processus dynamique qui exige une symphonie des repères extracellulaires des populations de cellules non-myocytes. En utilisant le traçage de la lignée, le CLARITY passif et les techniques de microscopie confocale à monture entière en trois dimensions, nous pouvons analyser l’influence d’une variété de types de cellules sur la réparation cardiaque et la régénération.

Abstract

Les maladies cardiovasculaires surclassent toutes les autres causes de décès et sont responsables d’un nombre stupéfiant de 31 % des mortalités dans le monde. Cette maladie se manifeste dans les dommages cardiaques, principalement sous la forme d’une infarctus aigu du myocarde. Avec peu de résilience suite à une blessure, le tissu cardiaque une fois en bonne santé sera remplacé par du tissu cicatriciel fibreux et non contractuel et souvent un prélude à l’insuffisance cardiaque. Pour identifier de nouvelles options de traitement en médecine régénérative, la recherche s’est concentrée sur les vertébrés avec des capacités régénératrices innées. Un tel organisme modèle est la souris néonatale, qui répond aux dommages cardiaques avec la régénération myocardique robuste. Afin d’induire une blessure dans la souris néonatale qui est cliniquement pertinente, nous avons développé une chirurgie pour occlude l’artère descendante antérieure gauche (LAD), reflétant une infarctus du myocarde déclenchée par l’athérosclérose dans le coeur humain. Lorsqu’il est jumelé à la technologie pour suivre les changements à la fois au sein des populations cardiomyocytes et non-myocytes, ce modèle nous fournit une plate-forme pour identifier les mécanismes qui guident la régénération cardiaque. L’amélioration des changements dans les populations de cellules cardiaques à la suite d’une blessure reposait autrefois fortement sur des méthodes telles que la section tissulaire et l’examen histologique, qui sont limitées à l’analyse bidimensionnelle et endommagent souvent le tissu dans le processus. En outre, ces méthodes n’ont pas la capacité de retracer les changements dans les lignées cellulaires, au lieu de fournir simplement un instantané de la réponse aux blessures. Ici, nous décrivons comment les méthodes technologiquement avancées dans les modèles de traçage de lignée, le dégagement entier d’organe, et la microscopie entière tridimensionnelle (3D) de montage entier peuvent être employées pour élucider des mécanismes de réparation cardiaque. Avec notre protocole pour la chirurgie néonatale d’infarctus du myocarde de souris, le dégagement de tissu, et la formation image entière d’organe de 3D, les voies complexes qui induisent la prolifération cardiomyocyte peuvent être démêlées, révélant de nouvelles cibles thérapeutiques pour la régénération cardiaque.

Introduction

Le cœur a longtemps été considéré comme un organe post-mitotic, mais des preuves récentes démontrent que le renouvellement cardiomyocyte se produit dans le cœur humain adulte à environ 1% par an¹. Cependant, ces faibles taux de rotation de cardiomyocyte sont insuffisants pour reconstituer la perte massive de tissu qui se produit après des dommages. Un cœur qui a subi une infarctus du myocarde perdra environ un milliard de cardiomyocytes, servant souvent de prélude à l’insuffisance cardiaque et la mort cardiaque soudaine^2,3. Avec plus de 26 millions de personnes touchées par l’insuffisance cardiaque dans le monde, il ya un besoin non satisfait de thérapies qui peuvent inverser les dommages infligés par la maladie cardiaque⁴.

Afin de combler cette lacune dans la thérapeutique, les scientifiques ont commencé à étudier les mécanismes évolutivement conservés qui sous-tendent la régénération endogène après des dommages. Un modèle pour étudier la régénération cardiaque des mammifères est la souris néonatale. Dans la semaine qui suit la naissance, les souris néonatales ont une réponse régénératrice robuste suite à des dommages cardiaques⁵. Nous avons déjà démontré que les souris néonatales peuvent régénérer leur cœur par la prolifération cardiomyocyte suite à une résection apique⁵. Bien que cette technique puisse évoquer la régénération cardiaque dans les nouveau-nés, la chirurgie manque de pertinence clinique aux dommages cardiaques humains. Afin d’imiter une blessure humaine dans le modèle néonatal de souris, nous avons développé une technique pour induire une infarctus du myocarde par une occlusion coronaire⁶. Cette technique nécessite la ligature chirurgicale de l’artère descendante antérieure gauche (LAD), qui est responsable de la livraison de 40%-50% du sang au myocarde ventriculaire gauche^6,7. Ainsi, la chirurgie entraîne une infarctus qui affecte une partie significative de la paroi ventriculaire gauche. Ces dommages au myocarde stimuleront la prolifération cardiomyocyte et la régénération cardiaque dans les nouveau-nés⁵.

La chirurgie d’occlusion de l’artère coronaire fournit une méthode hautement reproductible et directement translationnelle pour découvrir le fonctionnement interne de la régénération cardiaque. La chirurgie néonatale parallèle à l’athérosclérose de l’artère coronaire dans le cœur humain, où l’accumulation de la plaque dans les parois intérieures des artères peut causer une occlusion et l’infarctus du myocarde suivant⁸. En raison d’un vide dans les traitements thérapeutiques pour les patients souffrant d’insuffisance cardiaque, une occlusion dans le LAD est associée à des taux de mortalité atteignant jusqu’à 26% dans l’année suivant la blessure⁹, et par conséquent a été appelé le «fabricant de veuves». Les progrès de la thérapeutique exigent un modèle qui reflète fidèlement les effets physiologiques et pathologiques complexes des lésions cardiaques. Notre protocole chirurgical pour les lésions cardiaques néonatales de souris fournit une plate-forme qui permet aux chercheurs d’étudier les indices moléculaires et cellulaires qui signalent la régénération de coeur de mammifères après la blessure.

Des recherches récentes mettent en évidence la relation dynamique entre l’environnement extracellulaire et la prolifération des cardiomyocytes. Par exemple, la fenêtre régénératrice postnatale peut être prolongée en diminuant la rigidité de la matrice extracellulaire entourant le cœur¹⁰. Les biomatériaux de la matrice extracellulaire néonatale peuvent également favoriser la régénération cardiaque dans les cœurs de mammifères adultes à la suite d’une blessure cardiaque¹¹. La prolifération cardiomyocyte accompagne également une réponse angiogénique^12,13; la formation d’artère collatérale unique au coeur régénérant de la souris néonatale s’est avérée essentielle pour stimuler la régénération cardiaque¹². En outre, notre laboratoire a démontré que la signalisation nerveuse régule la prolifération cardiomyocyte et la régénération cardiaque par modulation des niveaux de facteur de croissance, ainsi que la réponse inflammatoire après la blessure¹⁴. Ces résultats soulignent la nécessité de retracer les populations de cellules non myocytes en réponse aux dommages cardiaques. Afin d’atteindre cet objectif, nous avons profité du système de recombinaison Cre-lox dans les lignées de souris transgéniques pour incorporer l’expression constitutive ou conditionnelle des protéines de journaliste fluorescent pour le traçage de la lignée. En outre, nous pouvons utiliser des méthodes avancées pour déterminer le modèle d’expansion clonale avec la ligne de souris Rainbow, qui s’appuie sur l’expression stochastique des cre-dépendants, multi-couleurs des journalistes fluorescents pour déterminer l’expansion clonale des populations cellulaires ciblées¹⁵. L’utilisation de la traçabilité de lignée avec la chirurgie néonatale d’occlusion d’artère coronaire est un outil puissant pour disséquer les mécanismes cellulaires complexes de la régénération cardiaque.

Il est difficile de suivre la lignée des cellules étiquetées fluorescentes à l’imagerie d’organes entiers tridimensionnelles (3D) en utilisant la technique traditionnelle de sectionnement et de reconstruction, en particulier lorsque les populations cellulaires sont fragiles, comme les fibres nerveuses ou les vaisseaux sanguins. Tandis que l’imagerie complète directe de l’organe par section optique peut capturer des populations superficielles de cellules, les structures qui résident profondément dans le tissu restent inaccessibles. Pour contourner ces barrières, des techniques de compensation tissulaire ont été développées pour réduire l’opacité des tissus d’organes entiers. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés pour effacer les méthodes compatibles acrylamide-hybridées d’imagerie rigide compatibles à l’imagerie par les lipides, les méthodes basées sur le tissu hYdrogel (CLARITY), qui effacent les tissus fixes par extraction lipidique¹⁶. Des mesures sont également prises pour homogénéiser l’indice réfractivant et réduire par la suite la diffusion de la lumière lors de l’imagerie¹⁷. Une telle méthode est active CLARITY, qui accélère la décomposition des lipides en utilisant l’électrophorèse pour pénétrer le détergent dans tout le tissu¹⁸. Bien qu’efficace, cette méthode de compensation tissulaire nécessite un équipement coûteux et peut causer des lésions tissulaires, ce qui rend l’approche incompatible avec les populations cellulaires fragiles telles que les nerfs cardiaques¹⁹. Ainsi, nous utilisons l’approche passive CLARITY, qui repose sur la chaleur pour faciliter doucement la pénétration du détergent, contribuant ainsi à la rétention des structures cellulaires complexes^20,21.

La CLARITY passive est généralement considérée comme moins efficace que LA CLARITY¹⁸active, car la technique est souvent accompagnée de deux obstacles majeurs : l’incapacité à effacer toute la profondeur de l’organe et la quantité considérable de temps nécessaire pour effacer les tissus adultes. Notre approche passive CLARITY surmonte ces deux barrières grâce à un processus de compensation accéléré capable de nettoyer complètement les tissus cardiaques néonatals et adultes. Notre technique passive de compensation des tissus CLARITY a atteint une efficacité qui permet la visualisation d’une variété de populations de cellules cardiaques, y compris les populations rares réparties dans tout le cœur adulte. Lorsque le cœur dégagé est photographié avec la microscopie confocale, l’architecture des motifs spécifiques aux cellules pendant le développement, la maladie et la régénération peut être éclairée.

Protocol

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide pour l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire et conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’École de médecine et de santé publique de l’Université du Wisconsin-Madison. Toutes les méthodes ont été effectuées sur le type sauvage C57BL/6J (B6) et les lignées de souris transgéniques obtenues auprès des laboratoires Jackson. 1. Occlusion coronaire (Infarctus du myo…

Representative Results

Souvent, les deux étapes les plus difficiles guident le cœur hors de la cavité thoracique et ligatant le LAD. Pour dépanner ces étapes, des ajustements peuvent être apportés au placement de la ponction initiale entre les quatrièmes muscles intercostal; si la ponction et la dissection émoussée sont trop proches du sternum, le cœur peut ne pas être en mesure de sortir de la cavité thoracique(figure 1A). En outre, une pression accrue sur…

Discussion

Les interactions cellulaires entre les cardiomyocytes et les populations non myocytes sont un facteur déterminant de la question de savoir si le cœur subira la fibrose ou la réparation après une blessure. Des découvertes ont été faites démontrant qu’une variété de types de cellules, y compris les nerfs¹⁴, les cellules épicardiales²⁴, macrophages péritonéaux²⁵, artérioles^12,13,…

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator