Fånga hjärtskada svar av riktade cellpopulationer via rensat hjärta tredimensionell imaging

Summary

Cardiomyocyte spridning efter skada är en dynamisk process som kräver en symfoni av extracellulära ledtrådar från icke-myocyte cellpopulationer. Med hjälp av härstamning spårning, passiv KLARHET, och tredimensionella helmonterade confocal mikroskopi tekniker, kan vi analysera påverkan av en mängd olika celltyper på hjärt reparation och förnyelse.

Abstract

Hjärt-kärlsjukdom överträffar alla andra dödsorsaker och är ansvarig för en svindlande 31% av dödligheten i världen. Denna sjukdom manifesterar sig i hjärtskada, främst i form av en akut hjärtinfarkt. Med lite motståndskraft efter skada, en gång frisk hjärtvävnad kommer att ersättas av fibrösa, icke-kontraktila ärrvävnad och ofta vara ett förspel till hjärtsvikt. För att identifiera nya behandlingsalternativ inom regenerativ medicin har forskningen fokuserat på ryggradsdjur med medfödd regenerativ förmåga. En sådan modell organism är neonatal musen, som svarar på hjärtskada med robust hjärtinfarkt förnyelse. För att framkalla en skada i neonatal musen som är kliniskt relevant, har vi utvecklat en operation för att ocklude den vänstra främre fallande artär (LAD), speglar en hjärtinfarkt utlöses av åderförkalkning i det mänskliga hjärtat. När matchas med tekniken för att spåra förändringar både inom kardiomyocyter och icke-myocyter populationer, ger denna modell oss en plattform för att identifiera de mekanismer som styr hjärtförnyelse. Få insikt i förändringar i hjärtcell populationer efter skada en gång förlitat sig starkt på metoder såsom vävnad snittning och histologisk undersökning, som är begränsade till tvådimensionell analys och ofta skada vävnaden i processen. Dessutom saknar dessa metoder förmågan att spåra förändringar i celllinjer, i stället ger bara en ögonblicksbild av skadesvaret. Här beskriver vi hur tekniskt avancerade metoder i härstamningsspårningsmodeller, hela organröjning och tredimensionell (3D) helmonterad mikroskopi kan användas för att belysa mekanismer för hjärtreparation. Med vårt protokoll för neonatal mus hjärtinfarkt kirurgi, vävnad clearing, och 3D hela organ imaging, de komplexa vägar som inducerar kardiomyocyt spridning kan redas ut, avslöjar nya terapeutiska mål för hjärt förnyelse.

Introduction

Hjärtat har länge ansetts vara ett postmitotiska organ, men de senaste bevisen visar att kardiomyocyte förnyelse sker i den vuxna mänskliga hjärtat på ca 1% per år¹. Emellertid, dessa låga nivåer av kardiomyocyte omsättning är otillräckliga för att fylla på den massiva förlust av vävnad som uppstår efter skada. Ett hjärta som har drabbats av en hjärtinfarkt kommer att förlora cirka en miljard kardiomyocyter, ofta fungerar som ett förspel till hjärtsvikt och plötslig hjärtdöd^2,3. Med över 26 miljoner människor som drabbats av hjärtsvikt över hela världen, det finns ett otillfredsställt behov av terapier som kan vända de skador som orsakats av hjärtsjukdom⁴.

För att överbrygga denna klyfta i therapeutics, forskare har börjat undersöka evolutionärt bevarade mekanismer som ligger bakom endogen ageneration efter skada. En modell för att studera däggdjur hjärt förnyelse är neonatal musen. Inom veckan efter födseln, neonatal möss har en robust regenerativ respons efter hjärtskador⁵. Vi har tidigare visat att neonatal möss kan regenerera sitt hjärta via kardiomyocyt spridning efter en apikal samband⁵. Även om denna teknik kan framkalla hjärtförnyelse hos nyfödda, saknar operationen klinisk relevans för mänskliga hjärtskador. För att efterlikna en mänsklig skada i neonatal mus modell, har vi utvecklat en teknik för att inducera en hjärtinfarkt genom en kranskärl ocklusion⁶. Denna teknik kräver kirurgisk ligation av den vänstra främre fallande artär (LAD), som ansvarar för att leverera 40%-50% av blodet till vänster Ventrikulärt hjärtmuskeln^6,7. Således resulterar operationen i en infarct som påverkar en betydande del av den vänstra Ventrikulärt väggen. Denna skada på hjärtmuskeln kommer att stimulera kardiomyocyt spridning och hjärtförnyelse hos nyfödda⁵.

Den kranskärlocklusion kirurgi ger en mycket reproducerbar och direkt translationell metod för att avslöja det inre arbetet i hjärt förnyelse. Neonatal kirurgi paralleller kranskärlsförkalkning i det mänskliga hjärtat, där ansamling av plack inom de inre väggarna i artärerna kan orsaka en ocklusion och efterföljande hjärtinfarkt⁸. På grund av ett tomrum i terapeutiska behandlingar för hjärtsvikt patienter, en ocklusion i LAD är associerad med dödligheten når upp till 26% inom ett år efter skada⁹, och följaktligen har kallats “änka maker.” Framsteg i therapeutics kräver en modell som exakt återspeglar de komplexa fysiologiska och patologiska effekterna av hjärtskada. Vårt kirurgiska protokoll för neonatal mus hjärtskada ger en plattform som gör det möjligt för forskare att undersöka molekylära och cellulära ledtrådar som signalerar däggdjur hjärtförnyelse efter skada.

Ny forskning belyser det dynamiska förhållandet mellan den extracellulära miljön och prolifererande kardiomyocyter. Till exempel kan det postnatala regenerativa fönstret förlängas genom att minska styvheten i den extracellulära matrisen som omger hjärtat¹⁰. Biomaterial från neonatal extracellulär matris kan också främja hjärtförnyelse i vuxna däggdjurshjärtan efter hjärtskada¹¹. Också medföljande kardiomyocyte spridning är en angiogenic svar^12,13; säkerheter artär bildning unik för regenererande hjärtat av neonatal musen visade sig vara avgörande för att stimulera hjärt förnyelse¹². Dessutom har vårt labb visat att nervsignalering reglerar kardiomyocyte spridning och hjärtförnyelse via modulering av tillväxtfaktornivåer, samt den inflammatoriska svar efter skada¹⁴. Dessa resultat betonar behovet av att spåra icke-myocyte cellpopulationer som svar på hjärtskada. För att uppnå detta mål har vi utnyttjat Cre-lox rekombinationssystem i transgena möss linjer för att införliva konstituerande eller villkorligt uttryck för fluorescerande reporter proteiner för härstamning spårning. Dessutom kan vi använda avancerade metoder för att bestämma klonal expansion mönster med Rainbow muslinjen, som bygger på stokastiska uttryck för Cre-beroende, multi-color fluorescerande reportrar för att bestämma klonal expansion av riktade cellpopulationer¹⁵. Använda härstamning spårning med neonatal kranskärl ocklusion kirurgi är ett kraftfullt verktyg för att dissekera intrikata cellulära mekanismer för hjärt förnyelse.

Spåra härstamning av fluorescerande märkta celler med tredimensionella (3D) hela organ avbildning är svårt att uppnå med hjälp av traditionella snittning och återuppbyggnad teknik – särskilt när cellpopulationer är bräckliga, såsom nervfibrer eller blodkärl. Medan direkt helmonterad avbildning av organet genom optisk snittning kan fånga ytliga cellpopulationer, strukturer som bor djupt inne i vävnaden förblir otillgängliga. För att kringgå dessa hinder har vävnadsröjningstekniker utvecklats för att minska opaciteten hos hela organvävnader. Nyligen har betydande framsteg gjorts för att rensa Lipid-utbytte Akrylamid-hybridiserade Rigid Imaging kompatibla Vävnad hYdrogel (CLARITY)-baserade metoder, som rensar fast vävnad via lipidextraktion¹⁶. Åtgärder vidtas också för att homogenisera brytningsindexet och därefter minska ljusspridning medan bildbehandling¹⁷. En sådan metod är aktiv KLARHET, som påskyndar lipidnedbrytning med hjälp av elektrofores för att penetrera tvättmedlet i hela vävnaden¹⁸. Även effektiv, denna vävnad clearingmetod kräver dyr utrustning och kan orsaka vävnadsskador, vilket gör tillvägagångssättet oförenligt med bräckliga cellpopulationer såsom hjärt nerver¹⁹. Därför använder vi passiv CLARITY-metoden, som är beroende av värme för att försiktigt underlätta tvättmedelspenetration, och därför medhjälp till att behålla invecklade cellstrukturer^20,,21.

Passiv klarhet anses vanligtvis vara mindre effektiv än aktiv CLARITY¹⁸, eftersom tekniken ofta åtföljs av två stora hinder: oförmågan att rensa hela organdjupet och den omfattande tid som krävs för att rensa vuxna vävnader. Vår passiva CLARITY strategi övervinner båda dessa hinder med en expeditated clearing process som kan helt rensa neonatal och vuxna hjärtvävnad. Vår passiva CLARITY vävnad clearing teknik har nått en effektivitet som tillåter visualisering av en mängd olika hjärtcell populationer, inklusive sällsynta populationer distribueras i hela det vuxna hjärtat. När det rensade hjärtat avbildars med konfokal mikroskopi kan arkitekturen för cellspecifik mönsterunder utveckling, sjukdom och regenerering belysas.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med guiden för användning och vård av försöksdjur och i enlighet med kommittén för institutionsvård och användning vid School of Medicine and Public Health vid University of Wisconsin-Madison. Alla metoder utfördes på vild typ C57BL/6J (B6) och transgena muslinjer som erhållits från Jackson Laboratories. 1. Födans gatan ocklusion (hjärtinfarkt) inducerad via ligring av vänster främre fallande artär (LAD) i 1-dagars gamla neonatal möss<sup c…

Representative Results

Ofta de två mest utmanande stegen är att styra hjärtat ur brösthålan och ligating LAD. För att felsöka dessa steg kan justeringar göras vid placeringen av den första punkteringen mellan de fjärde interkostnadsmusklerna; Om punkteringen och trubbigdissektionen är för nära i närheten av bröstbenet, kanske hjärtat inte kan lämna brösthålan (figur 1A). Dessutom kan ökat tryck på vänster buk behövas för att underlätta denna pro…

Discussion

Cell-cell interaktioner mellan kardiomyocyter och icke-myocyte populationer är en avgörande faktor för om hjärtat kommer att genomgå fibros eller reparation efter skada. Upptäckter har gjorts visar att en mängd olika celltyper, inklusive nerver¹⁴, epicardial celler²⁴, peritoneal makrofager²⁵, arterioles^12,13, och lymfatiska endotelceller²⁶, alla spelar en viktig…

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator