Cardiomyocyte spridning efter skada är en dynamisk process som kräver en symfoni av extracellulära ledtrådar från icke-myocyte cellpopulationer. Med hjälp av härstamning spårning, passiv KLARHET, och tredimensionella helmonterade confocal mikroskopi tekniker, kan vi analysera påverkan av en mängd olika celltyper på hjärt reparation och förnyelse.
Hjärt-kärlsjukdom överträffar alla andra dödsorsaker och är ansvarig för en svindlande 31% av dödligheten i världen. Denna sjukdom manifesterar sig i hjärtskada, främst i form av en akut hjärtinfarkt. Med lite motståndskraft efter skada, en gång frisk hjärtvävnad kommer att ersättas av fibrösa, icke-kontraktila ärrvävnad och ofta vara ett förspel till hjärtsvikt. För att identifiera nya behandlingsalternativ inom regenerativ medicin har forskningen fokuserat på ryggradsdjur med medfödd regenerativ förmåga. En sådan modell organism är neonatal musen, som svarar på hjärtskada med robust hjärtinfarkt förnyelse. För att framkalla en skada i neonatal musen som är kliniskt relevant, har vi utvecklat en operation för att ocklude den vänstra främre fallande artär (LAD), speglar en hjärtinfarkt utlöses av åderförkalkning i det mänskliga hjärtat. När matchas med tekniken för att spåra förändringar både inom kardiomyocyter och icke-myocyter populationer, ger denna modell oss en plattform för att identifiera de mekanismer som styr hjärtförnyelse. Få insikt i förändringar i hjärtcell populationer efter skada en gång förlitat sig starkt på metoder såsom vävnad snittning och histologisk undersökning, som är begränsade till tvådimensionell analys och ofta skada vävnaden i processen. Dessutom saknar dessa metoder förmågan att spåra förändringar i celllinjer, i stället ger bara en ögonblicksbild av skadesvaret. Här beskriver vi hur tekniskt avancerade metoder i härstamningsspårningsmodeller, hela organröjning och tredimensionell (3D) helmonterad mikroskopi kan användas för att belysa mekanismer för hjärtreparation. Med vårt protokoll för neonatal mus hjärtinfarkt kirurgi, vävnad clearing, och 3D hela organ imaging, de komplexa vägar som inducerar kardiomyocyt spridning kan redas ut, avslöjar nya terapeutiska mål för hjärt förnyelse.
Hjärtat har länge ansetts vara ett postmitotiska organ, men de senaste bevisen visar att kardiomyocyte förnyelse sker i den vuxna mänskliga hjärtat på ca 1% per år1. Emellertid, dessa låga nivåer av kardiomyocyte omsättning är otillräckliga för att fylla på den massiva förlust av vävnad som uppstår efter skada. Ett hjärta som har drabbats av en hjärtinfarkt kommer att förlora cirka en miljard kardiomyocyter, ofta fungerar som ett förspel till hjärtsvikt och plötslig hjärtdöd2,3. Med över 26 miljoner människor som drabbats av hjärtsvikt över hela världen, det finns ett otillfredsställt behov av terapier som kan vända de skador som orsakats av hjärtsjukdom4.
För att överbrygga denna klyfta i therapeutics, forskare har börjat undersöka evolutionärt bevarade mekanismer som ligger bakom endogen ageneration efter skada. En modell för att studera däggdjur hjärt förnyelse är neonatal musen. Inom veckan efter födseln, neonatal möss har en robust regenerativ respons efter hjärtskador5. Vi har tidigare visat att neonatal möss kan regenerera sitt hjärta via kardiomyocyt spridning efter en apikal samband5. Även om denna teknik kan framkalla hjärtförnyelse hos nyfödda, saknar operationen klinisk relevans för mänskliga hjärtskador. För att efterlikna en mänsklig skada i neonatal mus modell, har vi utvecklat en teknik för att inducera en hjärtinfarkt genom en kranskärl ocklusion6. Denna teknik kräver kirurgisk ligation av den vänstra främre fallande artär (LAD), som ansvarar för att leverera 40%-50% av blodet till vänster Ventrikulärt hjärtmuskeln6,7. Således resulterar operationen i en infarct som påverkar en betydande del av den vänstra Ventrikulärt väggen. Denna skada på hjärtmuskeln kommer att stimulera kardiomyocyt spridning och hjärtförnyelse hos nyfödda5.
Den kranskärlocklusion kirurgi ger en mycket reproducerbar och direkt translationell metod för att avslöja det inre arbetet i hjärt förnyelse. Neonatal kirurgi paralleller kranskärlsförkalkning i det mänskliga hjärtat, där ansamling av plack inom de inre väggarna i artärerna kan orsaka en ocklusion och efterföljande hjärtinfarkt8. På grund av ett tomrum i terapeutiska behandlingar för hjärtsvikt patienter, en ocklusion i LAD är associerad med dödligheten når upp till 26% inom ett år efter skada9, och följaktligen har kallats “änka maker.” Framsteg i therapeutics kräver en modell som exakt återspeglar de komplexa fysiologiska och patologiska effekterna av hjärtskada. Vårt kirurgiska protokoll för neonatal mus hjärtskada ger en plattform som gör det möjligt för forskare att undersöka molekylära och cellulära ledtrådar som signalerar däggdjur hjärtförnyelse efter skada.
Ny forskning belyser det dynamiska förhållandet mellan den extracellulära miljön och prolifererande kardiomyocyter. Till exempel kan det postnatala regenerativa fönstret förlängas genom att minska styvheten i den extracellulära matrisen som omger hjärtat10. Biomaterial från neonatal extracellulär matris kan också främja hjärtförnyelse i vuxna däggdjurshjärtan efter hjärtskada11. Också medföljande kardiomyocyte spridning är en angiogenic svar12,13; säkerheter artär bildning unik för regenererande hjärtat av neonatal musen visade sig vara avgörande för att stimulera hjärt förnyelse12. Dessutom har vårt labb visat att nervsignalering reglerar kardiomyocyte spridning och hjärtförnyelse via modulering av tillväxtfaktornivåer, samt den inflammatoriska svar efter skada14. Dessa resultat betonar behovet av att spåra icke-myocyte cellpopulationer som svar på hjärtskada. För att uppnå detta mål har vi utnyttjat Cre-lox rekombinationssystem i transgena möss linjer för att införliva konstituerande eller villkorligt uttryck för fluorescerande reporter proteiner för härstamning spårning. Dessutom kan vi använda avancerade metoder för att bestämma klonal expansion mönster med Rainbow muslinjen, som bygger på stokastiska uttryck för Cre-beroende, multi-color fluorescerande reportrar för att bestämma klonal expansion av riktade cellpopulationer15. Använda härstamning spårning med neonatal kranskärl ocklusion kirurgi är ett kraftfullt verktyg för att dissekera intrikata cellulära mekanismer för hjärt förnyelse.
Spåra härstamning av fluorescerande märkta celler med tredimensionella (3D) hela organ avbildning är svårt att uppnå med hjälp av traditionella snittning och återuppbyggnad teknik – särskilt när cellpopulationer är bräckliga, såsom nervfibrer eller blodkärl. Medan direkt helmonterad avbildning av organet genom optisk snittning kan fånga ytliga cellpopulationer, strukturer som bor djupt inne i vävnaden förblir otillgängliga. För att kringgå dessa hinder har vävnadsröjningstekniker utvecklats för att minska opaciteten hos hela organvävnader. Nyligen har betydande framsteg gjorts för att rensa Lipid-utbytte Akrylamid-hybridiserade Rigid Imaging kompatibla Vävnad hYdrogel (CLARITY)-baserade metoder, som rensar fast vävnad via lipidextraktion16. Åtgärder vidtas också för att homogenisera brytningsindexet och därefter minska ljusspridning medan bildbehandling17. En sådan metod är aktiv KLARHET, som påskyndar lipidnedbrytning med hjälp av elektrofores för att penetrera tvättmedlet i hela vävnaden18. Även effektiv, denna vävnad clearingmetod kräver dyr utrustning och kan orsaka vävnadsskador, vilket gör tillvägagångssättet oförenligt med bräckliga cellpopulationer såsom hjärt nerver19. Därför använder vi passiv CLARITY-metoden, som är beroende av värme för att försiktigt underlätta tvättmedelspenetration, och därför medhjälp till att behålla invecklade cellstrukturer20,,21.
Passiv klarhet anses vanligtvis vara mindre effektiv än aktiv CLARITY18, eftersom tekniken ofta åtföljs av två stora hinder: oförmågan att rensa hela organdjupet och den omfattande tid som krävs för att rensa vuxna vävnader. Vår passiva CLARITY strategi övervinner båda dessa hinder med en expeditated clearing process som kan helt rensa neonatal och vuxna hjärtvävnad. Vår passiva CLARITY vävnad clearing teknik har nått en effektivitet som tillåter visualisering av en mängd olika hjärtcell populationer, inklusive sällsynta populationer distribueras i hela det vuxna hjärtat. När det rensade hjärtat avbildars med konfokal mikroskopi kan arkitekturen för cellspecifik mönsterunder utveckling, sjukdom och regenerering belysas.
Cell-cell interaktioner mellan kardiomyocyter och icke-myocyte populationer är en avgörande faktor för om hjärtat kommer att genomgå fibros eller reparation efter skada. Upptäckter har gjorts visar att en mängd olika celltyper, inklusive nerver14, epicardial celler24, peritoneal makrofager25, arterioles12,13, och lymfatiska endotelceller26, alla spelar en viktig…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering för detta projekt tillhandahölls av UW School of Medicine and Public Health från Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), och en American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).
1-thioglycerol | |||
6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
Acrylamide | |||
Boric acid | |||
Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
Paraformaldehyde | |||
Phosphate Buffer | |||
Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
Sodium Azide | |||
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |