Optagelse af hjerteskaderespons af målrettede cellepopulationer via clearet hjerte tredimensionel billeddannelse

Summary

Cardiomyocyt spredning efter skade er en dynamisk proces, der kræver en symfoni af ekstracellulære signaler fra ikke-myocyte cellepopulationer. Ved hjælp af afstamning sporing, passiv KLARHED, og tre-dimensionelle hel-mount konfokal mikroskopi teknikker, kan vi analysere indflydelsen af en række forskellige celletyper på hjerte reparation og regenerering.

Abstract

Hjerte-kar-sygdom overgår alle andre dødsårsager og er ansvarlig for en svimlende 31% af dødeligheden på verdensplan. Denne sygdom manifesterer sig i hjerteskade, primært i form af en akut myokardieinfarkt. Med lidt modstandskraft efter skade, den gang sundt hjertevæv vil blive erstattet af fibrøst, ikke-kontraktile arvæv og ofte være en optakt til hjertesvigt. For at identificere nye behandlingsmuligheder inden for regenerativ medicin har forskningen fokuseret på hvirveldyr med medfødte regenerative evner. En sådan model organisme er neonatal mus, som reagerer på hjerteskade med robust myokardieregenerering. For at fremkalde en skade i neonatal mus, der er klinisk relevant, har vi udviklet en operation for at okkludere den venstre anterior faldende arterie (LAD), spejling en myokardieinfarkt udløst af åreforkalkning i det menneskelige hjerte. Når matchet med teknologien til at spore ændringer både inden for kardiomyocytter og ikke-myocyte populationer, denne model giver os en platform til at identificere de mekanismer, der styrer hjerte regenerering. Få indsigt i ændringer i hjertecellepopulationer efter skade engang stolede stærkt på metoder såsom væv ssektioning og histologisk undersøgelse, som er begrænset til to-dimensionel analyse og ofte skader væv i processen. Desuden mangler disse metoder evnen til at spore ændringer i celleslægter, i stedet giver blot et øjebliksbillede af skadesreaktionen. Her beskriver vi, hvordan teknologisk avancerede metoder i afstamning sracing modeller, hele orgel clearing, og tre-dimensionelle (3D) hele mount mikroskopi kan bruges til at belyse mekanismer af hjertereparation. Med vores protokol for neonatal mus myokardieinfarkt kirurgi, væv clearing, og 3D hele organ imaging, de komplekse veje, der inducerer kardiomyocyt spredning kan optrævles, afslører nye terapeutiske mål for hjerte-regenerering.

Introduction

Hjertet har længe været anset for at være et post-mitotisk organ, men de seneste beviser viser, at kardiomyocyt fornyelse forekommer i det voksne menneskelige hjerte på omkring 1% om året¹. Men, disse lave satser for kardiomyocyte omsætning er utilstrækkelige til at genopbygge den massive tab af væv, der opstår efter skade. Et hjerte, der har lidt en myokardieinfarkt vil miste omkring en milliard kardiomyocytter, ofte tjener som en optakt til hjertesvigt og pludselig hjertedød^2,3. Med over 26 millioner mennesker ramt af hjertesvigt på verdensplan, er der et udækket behov for terapi, der kan vende de skader, som hjertesygdomme⁴.

For at bygge bro over denne kløft i terapeutisk, forskere er begyndt at undersøge evolutionært bevarede mekanismer, der ligger til grund endogen regenerering efter skade. En model til at studere pattedyr hjerteregenerering er neonatal mus. Inden for ugen efter fødslen har nyfødte mus et robust regenerativt respons efter hjerteskader⁵. Vi har tidligere vist, at neonatal mus kan regenerere deres hjerte via kardiomyocyt spredning efter en apikal resektion⁵. Selv om denne teknik kan fremkalde hjerteregenerering i nyfødte, mangler operationen klinisk relevans for menneskelige hjerteskader. For at efterligne en menneskelig skade i neonatal mus model, har vi udviklet en teknik til at fremkalde en myokardieinfarkt gennem en koronararterie okklusion⁶. Denne teknik kræver kirurgisk ligation af venstre anterior faldende arterie (LAD), som er ansvarlig for at levere 40%-50% af blodet til venstre ventrikulær myokardiet^6,7. Således, operationen resulterer i en infarkt, der påvirker en betydelig del af venstre ventrikelvæg. Denne skade på myokardiet vil stimulere kardiomyocyt spredning og hjerte regenerering i nyfødte⁵.

Koronararterieokklusionkirurgi giver en meget reproducerbar og direkte translationel metode til at afdække de indre funktioner i hjerteregenerering. Den neonatal kirurgi paralleller koronararterie åreforkalkning i det menneskelige hjerte, hvor ophobning af plak inden for de indre vægge af arterierne kan forårsage en okklusion og efterfølgende myokardieinfarkt⁸. På grund af et tomrum i terapeutiske behandlinger for hjertesvigt patienter, en okklusion i LAD er forbundet med dødelighed en nåede op til 26% inden for et år efter skade⁹, og derfor er blevet kaldt “enke maker.” Fremskridt inden for terapi kræver en model, der præcist afspejler de komplekse fysiologiske og patologiske virkninger af hjerteskade. Vores kirurgiske protokol for neonatal mus hjerteskade giver en platform, der giver forskerne mulighed for at undersøge de molekylære og cellulære signaler, der signalerer pattedyr hjerte regenerering efter skade.

Nyere forskning fremhæver det dynamiske forhold mellem det ekstracellulære miljø og prolifererende kardiomyocytter. For eksempel kan det postnatale regenerative vindue forlænges ved at mindske stivheden af den ekstracellulære matrix omkring hjertet¹⁰. Biomaterialer fra neonatal ekstracellulær matrix kan også fremme hjerte regenerering i voksne pattedyr hjerter efter hjerteskade¹¹. Også ledsagende kardiomyocyt spredning er en angiogenic respons^12,13; sikkerhedsstillelse arterie dannelse unikke for regenererende hjertet af neonatal musen viste sig at være afgørende for at stimulere hjerteregenerering¹². Desuden har vores laboratorium vist, at nerve signalering regulerer kardiomyocyt spredning og hjerte regenerering via graduering af vækstfaktor niveauer, samt den inflammatoriske reaktion efter skade¹⁴. Disse resultater understreger behovet for at spore ikke-myocyt cellepopulationer som reaktion på hjerteskade. For at nå dette mål, har vi benyttet os af Cre-lox rekombinationssystem i transgene mus linjer til at indarbejde konstituerende eller betinget udtryk for fluorescerende reporter proteiner til afstamning sporing. Desuden kan vi bruge avancerede metoder til at bestemme klonale ekspansion mønstre med Rainbow muselinje, som er afhængig af stokastiske udtryk for Cre-afhængige, multi-farve fluorescerende journalister til at bestemme klonal udvidelse af målrettede cellepopulationer¹⁵. Beskæftiger afstamning opsporing med neonatal koronararterie okklusion kirurgi er et kraftfuldt værktøj til at dissekere de indviklede cellulære mekanismer hjerteregenerering.

Sporing afstamning af fluorescerende mærkede celler med tre-dimensionelle (3D) hele organ imaging er vanskeligt at opnå ved hjælp af traditionelle skæring og genopbygning teknik – især når cellepopulationer er skrøbelige, såsom nervefibre eller blodkar. Mens direkte hel-mount billeddannelse af orglet ved optisk skæring kan fange overfladiske cellepopulationer, strukturer, der bor dybt inde i vævet forbliver utilgængelige. For at omgå disse barrierer er der udviklet vævsrydningsteknikker for at reducere opaciteten af hele organvæv. For nylig, betydelige fremskridt er blevet gjort for at Clear Lipid-udvekslede Acrylamid-hybridiseret Rigid Imaging kompatible Tissue hYdrogel (CLARITY)-baserede metoder, som klare fast væv via lipid ekstraktion¹⁶. Der tages også skridt til at homogenisere brydningsindekset og derefter reducere lysspredning, mens billeddannelse¹⁷. En sådan metode er aktiv CLARITY, som fremskynder lipid nedbrydning ved hjælp af elektroforese at trænge ind i vaskemiddel i hele vævet¹⁸. Selv om effektiv, denne væv clearing metode kræver dyrt udstyr og kan forårsage vævsskader, hvilket gør tilgangen uforenelig med skrøbelige cellepopulationer såsom hjertenerver¹⁹. Således anvender vi den passive CLARITY tilgang, som er afhængig af varme til forsigtigt at lette vaskemiddel penetration, derfor medvirken i fastholdelsen af indviklede cellestrukturer^20,21.

Passiv KLARHED menes typisk at være mindre effektiv end aktiv CLARITY¹⁸, da teknikken ofte ledsages af to store hindringer: den manglende evne til at rydde hele organdybden og den omfattende tid, der kræves for at rydde voksenvæv. Vores passive CLARITY tilgang overvinder begge disse barrierer med en fremskyndet clearing proces, der er i stand til fuldt ud at rydde neonatal og voksen hjertevæv. Vores passive CLARITY vævsrydningsteknik har nået en effektivitet, der gør det muligt at visualiseringaf en række hjertecellepopulationer, herunder sjældne populationer fordelt over hele det voksne hjerte. Når det ryddede hjerte er afbildet med konfokal mikroskopi, kan arkitekturen af celle-specifikke mønstre under udvikling, sygdom og regenerering belyses.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen for brug og pleje af laboratoriedyr og i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care and Use Committee i School of Medicine and Public Health ved University of Wisconsin-Madison. Alle metoder blev udført på vilde type C57BL/6J (B6) og transgene muselinjer fremstillet af Jackson Laboratories. 1. Koronararterie Okklusion (Myokardieinfarkt) Induceret via Ligation af venstre anterior faldende arterie (LAD) i 1-dags-gamle neonat…

Representative Results

Ofte er de to mest udfordrende trin vejlede hjertet ud af brysthulen og ligating LAD. For at foretage fejlfinding af disse trin kan der foretages justeringer i placeringen af den indledende punktering mellem de fjerde interkostale muskler. Hvis punkteringen og den stumpe dissektion er for tæt på brystbenet, kan hjertet muligvis ikke forlade brysthulen (figur 1A). Desuden kan øget pres på venstre mave være nødvendigt for at lette denne proces…

Discussion

Celle-celle interaktioner mellem kardiomyocytter og ikke-myocyt populationer er en afgørende faktor for, om hjertet vil gennemgå fibrose eller reparation efter skade. Opdagelser er blevet gjort viser, at en række celletyper, herunder nerver¹⁴, epikardieceller²⁴, peritoneal makrofager²⁵, arterioler^12,13, og lymfeformet endotelceller²⁶, alle spiller en væsentlig roll…

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator