후두절협증을 가진 마우스에 있는 생체 적합성 약 용출 기관 스텐트의 디자인
Summary
Laryngotracheal 협착증은 기관 기도를 비판적으로 좁히고 효과적인 의학 치료가 결여되는 병리학적인 흉터 침착에서 유래합니다. PLLA-PCL (70% 폴리-L-락티드 및 30% 폴리카프롤락톤) 스텐트를 국소 약물 전달 시스템으로 사용하여, 기관내 흉터 증식을 감소시키는 것을 목표로 하는 잠재적치료법을 연구할 수 있다.
Abstract
후두 척막증 (LTS)은 외인성 방해및 호흡곤란으로 이어지는 기관및 기관의 병리학적 협착입니다. LTS는 기관에서 이물질에서 점막 손상으로 인해 조직 손상및 병리학 적 흉터 조직의 침착으로 이어지는 국소 염증 반응을 초래합니다. LTS에 대한 치료는 효과적인 의료 치료의 부족으로 인해 수술이다. 이 방법의 목적은 LTS를 사용하여 마우스에 배치하기 위해 소형화 될 수있는 생체 적합성 스텐트를 구성하는 것입니다. 우리는 PLLA-PCL (70 % 폴리 L-락티드 및 30 % 폴리 카프로 롤락톤) 구성이 최적의 생체 역학 적 강도를 가지고 있으며 생체 적합성, 생체 내 배치 스텐트에 대한 실용성 및 용출 약물을 할 수 있음을 입증했습니다. 이 방법은 염증을 국소적으로 억제하고 기도 섬유증을 감소시키기 위해 다양한 면역 조절제를 테스트하기 위한 약물 전달 시스템을 제공한다. 스텐트를 제조하는 데는 28-30h가 소요되며 쉽게 재현할 수 있으므로 대형 코호트를 실험할 수 있습니다. 여기에서 우리는 섬유증과 콜라겐 침착을 감소시키는 그것의 효력을 시험하기 위하여 스텐트의 안에 약 rapamycin를 통합했습니다. 결과는 PLLA-PCL 텐트가 신뢰할 수 있는 라파마이신 방출을 보여주었고, 생리학적 조건에서 기계적으로 안정되었으며, 생체 적합성이 있었으며, 기관에서 염증 반응을 거의 유도하지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 라파마이신 용출 PLLA-PCL 스텐트는 생체 내 기관에서 흉터 형성을 감소시켰습니다.
Introduction
후두 절제 (LTS)는 자궁 내 외 삽관 손상으로 인해 기관의 병리학 적 협착이 가장 빈번합니다. 세균성 식민지화의 조합, 기관 절제술 또는 내시경 관에 대한 이물질 반응 및 환자 별 요인은 비정상적인 염증 반응으로 이어집니다. 이러한 부적응 면역 반응은 기관내 의 콜라겐 침착으로 이어지며, 기관 및 후속 협착의 발광 을 초래합니다1,2. 이 질병에 대한 현재의 치료는 주로 외과적이기 때문에, 과도한 콜라겐 침착으로 이어지는 비정상적인 염증 및 성섬유성 경로를 대상으로 하는 대체 의학 기반 치료 패러다임을 개발하는 것이 연구되고 있다. MTOR 신호 복합체를 억제하는 라파마이신은 면역 억제 효과뿐만 아니라 강력한 항섬유아세포 효과가 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 라파마이신이 체계적으로 투여되면 일반적인 부작용(예를 들어, 고지혈증, 빈혈, 혈소판 감소증)이 발음될 수있다 3. 우리의 방법론의 목적은 이러한 전신 효과를 줄이는 기도에서 사용하기 위해 실용적 인 국소 약물 전달을위한 차량을 개발하는 것입니다. 우리의 평가는 섬유아세포 기능을 억제하고 국소 면역 미세 환경을 변경하는 능력뿐만 아니라 약물 전달 구조에 대한 국소 면역 반응을 조사하는 데 중점을 둡니다. 질병 특정 결과는 섬유증의 마커를 평가하는 생체 내 시험을 포함합니다.
생분해성 약물 용출 스텐트는 기도4를포함한 여러 장기 시스템에서 질병의 동물 모델에서 사용되어 왔다. 기도 협착 또는 붕괴의 관리를 위해, 이전 조사는 약물 코팅 실리콘 및 니켈 기지를 둔 스텐트를사용했습니다 5. PLLA-PCL 시공은 3주 동안의 생리학적 조건에서의 약물 용출 프로파일 및 기계적 강도 때문에 이 특정 방법에 대해 선택되었으며, 이는 이전 발표된 연구에서 입증된6. PLLA-PCL은 또한 FDA4에의해 이미 승인 된 생체 적합성 및 생분해성 물질입니다. 시스플라틴과 MMC를 용출하는 생체 적합성 스텐트는 토끼와 개와 같은 대형 동물 모델에서 연구되었습니다. 그러나, 이러한 동물 모델에서, 스텐트는 질병의 동물 모델에 배치되지 않았고, 뇌전적으로 이식되었다. 본 연구는 기도 손상 및 후두 골착증의 마우스 모델에 횡단적으로 배치된 생체 적합성 약물 용출 스텐트를 평가하기 위한 독특한 방법을 제공한다. 면역 조절 약물을 국소적으로 용해시키고 뮤린 모델에서 연구를 위해 소형화 할 수있는 생체 적합성 스텐트는 번역 전 임상 연구에 유용합니다. 다른 재료 구성과 스텐트 활용에 대한 이전의 시도는 LTS7을구별하는 근본적인 염증을 악화시키는 강력한 이물질 반응을 생성했습니다. 이 방법론은, 우리의 지식에, LTS의 murine 모형에 있는 스텐트 기지를 둔 약 납품 시스템의 면역 조절 및 항섬유성 효력을 공부하는 그것의 종류의 첫번째입니다. 뮤린 모델 자체는 기관에 면역 조절 약물의 효과를 연구하기위한 몇 가지 장점을 제공합니다. 유전자 변형 마우스와 건강하고 병에 걸린 마우스의 실험 집단을 연구 할 수 있습니다, 이는 실험 재현으로 이어질 비용 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 더욱이, 마우스 기관으로 스텐트를 횡단적으로 전달하는 것은 인간에서 그러한 스텐트의 임상 적 전달을 모방하여, 이 방법의 번역적 이점을 더욱 강조한다. 마지막으로, 약물과 PLLA-PCL 스텐트가 생성 될 수있는 상대적 용이성은 기관에서 흉터 형성을 감소시키기위한 대체 약물 요법을 제공하기 위해 수정을 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 내에서 약물 용출 스텐트를 성공적으로 생성하고 사용하기 위한 가장 중요한 단계는 1) 바람직한 약물 용출 속도에 대한 최적의 PLLA-PCL 비율을 결정하고, 2) 용출될 약물의 적절한 농도를 결정하는 것, 3) 스텐트를 성형하는 것입니다. 생체 내 사용을 위한 angiocatheter 의 주위에, 및 4) 치명적인 기도 방해를 일으키지 않고 LTS 유도 후에 마우스로 스텐트를 장전하게 전달한다.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
수상 번호 1K23DC014082 및 1R21DC017225 (알렉산더 힐렐)에서 건강의 국립 연구소의 청각 장애 및 기타 통신 장애에 대한 국립 연구소. 이 연구는 또한 재정적으로 삼과 학회와 외과 의사의 미국 대학 (알렉산더 힐렐), 미국 의학 협회 재단, 시카고, 일리노이 (Madhavi Duvvuri) 및 T32 NIDCD 교육 보조금 (케빈 모츠)에 의해 지원되었다.
Materials
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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