La culture d’agrégats d’adipocytes matures de membrane (MAAC) est une nouvelle méthode pour la culture des adipocytes humains mûrs. Ici, nous détaillons comment isoler les adipocytes de l’adipose humain et comment mettre en place MAAC.
La dysrégulation des tissus adipeux blancs (WAT) joue un rôle central dans le développement de la résistance à l’insuline et du diabète de type 2 (T2D). Pour développer de nouveaux traitements pour le DT2, des modèles d’adipocytes in vitro plus pertinents sur le plan physiologique sont nécessaires. Cette étude décrit une nouvelle technique pour isoler et culturer les adipocytes humains matures. Cette méthode est intitulée MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), et par rapport à d’autres modèles in vitro adipocytes, MAAC possède une signature génétique adipogénique qui est le plus proche des adipocytes matures fraîchement isolés. En utilisant MAAC, les adipocytes peuvent être cultivés à partir de patients maigres et obèses, différents dépôts adipeux, co-cultivés avec différents types de cellules, et surtout, peuvent être conservés en culture pendant 2 semaines. Des expériences fonctionnelles peuvent également être effectuées sur MAAC, y compris l’absorption de glucose, la lipogénèse et la lipolyse. En outre, MAAC répond vigoureusement à l’agonisme pharmacologique divers et peut être employé pour étudier des changements phénotypiques d’adipocyte, y compris la transdifférenciation des adipocytes blancs dans les adipocytes bruns-comme.
L’augmentation mondiale des comorbidités liées à l’obésité nécessite le développement de nouvelles thérapies. Le tissu adipeux blanc (WAT) est un régulateur important du métabolisme de corps entier, de l’homéostasie d’énergie, et est un acteur central dans le développement de la résistance à l’insuline et du diabète de type 2 (T2D)1,2. Pendant la consommation excessive chronique de calories, les adipocytes agrandissent pour manipuler le surplus d’énergie. Cependant, la capacité de stockage de lipides d’adipocyte peut devenir dépassée, ayant pour résultat une élévation des niveaux circulants des acides gras et le stockage accru dans les tissus non-adipeuses périphériques et menant à la lipotoxicité3,4.
L’absence de modèles in vitro d’adipocyte s’il y a une grande pertinence translationnelle est un défi majeur dans le développement de nouveaux traitements contre l’obésité et le DT2. Le modèle ex vivo ex vivo explante, où de petits morceaux de tissu adipeux sont cultivés, est associé à des altérations rapides de l’expression génique adipogénique entraînée par l’hypoxie et l’inflammation5,6. Les cultures de plafond (CC) où les adipocytes mûrs flottent et adhèrent au dessus des flacons media-remplis, dédifférencient rapidement en cellules fibroblaste-comme manquant de lipide7,8,9,10. Le modèle le plus couramment utilisé est les adipocytes différenciés in vitro des précurseurs engagés. Les cellules différenciées sont, cependant, morphologiquement distinctes des adipocytes mûrs in vivo puisqu’elles sont beaucoup plus petites dans la taille et manquent d’une gouttelette de lipide uniloculaire. D’autres limitations avec ce modèle incluent le besoin non physiologique d’un cocktail chimique pour conduire la différenciation, aussi bien que la variabilité dans l’efficacité de différenciation qui peut être affectée par un certain nombre de facteurs11,12,13,14.
Nous avons récemment développé la culture d’agrégat d’adipocyte mûr de membrane (MAAC), une méthode pour la culture à long terme des adipocytes mûrs fraîchement isolés, où les adipocytes sont cultivés sous les membranes perméables10. L’analyse impartiale des données de séquençage d’ARN a prouvé que par rapport aux explants adipeux de tissu et aux adipocytes in vitro-différenciés, MAAC est plus semblable aux adipocytes fraîchement isolés. MAAC peut être employé pour la culture des adipocytes mûrs isolés du tissu adipeux sous-cutané et viscéral, aussi bien que des adipocytes des sujets obèses et maigres. Cette méthodologie permet l’étude des changements phénotypiques d’adipocyte à long terme et facilite la co-culture des adipocytes avec d’autres types de cellules. Ici nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des adipocytes mûrs du tissu adipeux humain et comment mettre en place le système MAAC.
La culture d’agrégats d’adipocytes matures de membrane (MAAC) est une nouvelle méthode pour la culture à long terme des adipocytes mûrs fraîchement isolés. Lors de la mise en place de MAAC, il y a quelques étapes critiques dans le protocole qui ont un impact considérable sur le rendement, la qualité et la viabilité des adipocytes matures. Beaucoup d’efforts devraient être mis dans le calcul de la graisse dans l’étape 3.2 puisque cette étape influence directement la quantité de temps les adipocytes sont exposés à la collagène. Si les morceaux d’adipose sont trop grands, le temps de digestion devra être prolongé, ce qui aura un impact négatif sur la viabilité des cellules. Inversement, si le tissu est traité trop finement avec des ciseaux, la viabilité peut également être affectée. Pour la culture réussie des adipocytes mûrs comme MAAC, on devrait accorder une attention particulière aux étapes suivantes : pour l’ensemencement réussi des adipocytes sur les membranes, il est crucial que le tampon libre de lavage de lipide et de report soit enlevé des adipocytes mûrs dans les étapes 5.3 et 5.4. Le reste des lipides ou tampon de lavage réduira la tension de surface des adipocytes et augmentera le risque que les adipocytes s’égouttent les membranes lorsqu’elles sont retournées. Lorsque les adipocytes sont ensedus et dans les médias, les cellules restent en contact avec la membrane principalement par flottabilité, donc une technique lente et douce est recommandée lors du changement de médias pour ne pas perdre de cellules. Retirez les supports du fond des puits tels que décrits à l’étape 7.1 et ajoutez des supports en pipetting lentement les médias sur les côtés des murs. Enfin, une suggestion de gain de temps est de préparer les plaques avec des médias et des traitements avant le processus d’isolement des adipocytes. En particulier pour les conceptions expérimentales complexes, la préparation des plaques peut faire gagner beaucoup de temps et garantit que les adipocytes sont placés dans les médias avec leurs traitements dès qu’ils sont isolés.
Un avantage de l’utilisation de MAAC par rapport à la différenciatisation des préadipocytes est que le média MAAC utilisé est très simple et ne nécessite pas un cocktail d’hormones non physiologiques. Ici, nous avons cultivé MAAC dans les médias riches en glucose (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn/strep, et 20 nM d’insuline. Fait important, nous avons constaté que l’insuline est absolument nécessaire pour la rosiglitazone / pioglitazone conduit induction de UCP110. L’insuline, cependant, n’est pas nécessaire pour maintenir le phénotype adipogenic des cellules. Ainsi, selon la question expérimentale, l’insuline peut être incluse ou omise.
La procédure détaillée ci-dessus a été optimisée pour l’isolement et la culture des adipocytes humains. Cependant, la souris, et peut-être les adipocytes d’autres organismes, peut également être cultivée comme MAAC. Si les adipocytes de souris doivent être cultivés comme MAAC il y a des considérations et des précautions additionnelles qui devraient être gardées à l’esprit. Nous avons constaté que les adipocytes matures de souris sont beaucoup plus fragiles que ceux des humains. En conséquence, le temps de digestion devrait être raccourci à un minimum absolu pour augmenter la viabilité cellulaire. Nous avons également constaté que les adipocytes de jeunes souris (8 semaines et plus jeunes) ont fourni les résultats les plus robustes et reproductibles. Enfin, la souris MAAC peut être cultivée jusqu’à une semaine, cependant étant donné que leur phénotype adipogénique semble moins stable que les humains (qui peuvent être cultivés pendant au moins deux semaines) nous recommandons de cultiver la souris MAAC pour le temps minimum requis pour traiter questions expérimentales.
Puisque le modèle de MAAC est basé sur l’utilisation des membranes perméables, un avantage de cette technique est la possibilité de co-crepage des adipocytes mûrs avec d’autres types de cellules. Nous avons déjà démontré la capacité des adipocytes et des macrophages mûrs à traverser par l’utilisation de MAAC10. Cela ouvre des possibilités d’explorer davantage le lien entre l’obésité, la résistance à l’insuline et les réponses immunitaires15,16,17. De futures expériences pourraient incorporer d’autres types de cellules tels que les hépatocytes, les préadipocytes, les cellules endothéliales ou les cellules pancréatiques afin d’accroître davantage la complexité et la pertinence translationnelle du modèle MAAC et d’étudier le lien entre plusieurs types de cellules.
Même si LE MAAC s’est avéré supérieur au maintien de la fonctionnalité et de l’identité des adipocytes par rapport à d’autres modèles in vitro d’adipocytes, il a également des limitations qui doivent être considérées. Par rapport à l’utilisation d’adipocytes différenciés des cellules précurseurs, MAAC est un modèle plus laborieux et long. Les plaques avec des membranes sont également plus chères par rapport aux plaques de culture cellulaire régulières. Fait important, les adipocytes matures doivent être fraîchement isolés à chaque fois après l’ensemencement et ne peuvent pas être étendus ou congelés en stocks comme les cellules précurseurs. Ainsi, cela nécessite d’avoir accès à des échantillons de tissus adipeux blancs frais, mais ajoute également un niveau de complexité découlant des variations du donneur au donneur.
Ici, nous avons présenté un protocole détaillé pour isoler les adipocytes matures humains et la mise en place de MAAC. Nous avons démontré que les adipocytes cultivés comme MAAC reste viable pendant deux semaines, leur signature adipogenic de gène est préservée, et ils répondent à l’agonisme pharmacologique divers. L’utilisation de MAAC permet l’étude des adipocytes betweeen et d’autres types de cellules, et l’évaluation des changements phénotypiques à long terme des adipocytes matures en réponse à différents stimuli.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Xiao-Rong Peng et Stefan Hallen d’avoir fourni des ressources et d’avoir optimisé l’isolement des adipocytes, Martin Uhrbom pour son assistance technique, et Daniel Olausson et Malin Lunn d’avoir coordonné et fourni l’adipose humaine.
Autoclaved scissors | |||
Autoclaved spoons | |||
Autoclaved tweezers | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Conical tubes, 50 mL | |||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
Shaking incubator (37 °C) | |||
Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |