A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي
Summary
نحن وصف 3D الإنسان مصفوفة خارج الخلية-الخلايا الشحمية في المختبر نظام الثقافة التي تسمح تشريح ادوار المصفوفة والخلايا الشحمية في المساهمة في النسيج الدهني النمط الظاهري الأيضي.
Abstract
المصفوفة خارج الخلية (ECM) يلعب دورا محوريا في تنظيم التوازن الانسجه ، والانخراط في المتبادل مع الخلايا وتنظيم جوانب متعددة من وظيفة الخلوية. ال ECM يلعب دورا هاما بشكل خاص في وظيفة الانسجه الدهنية في السمنة ، والتعديلات في الانسجه الدهنية ترسب المحتوي والتركيب ترتبط بالامراض الايضيه في الفئران والبشر. النماذج العريكته في المختبر التي تسمح بتشريح ادوار ECM والخلايا في المساهمة في النمط الظاهري للانسجه العالمية هي متفرقة. ونحن نقدم رواية 3D في نموذج المختبر للثقافة البشرية ECM-الخلايا الشحمية التي تسمح بدراسة الأدوار المحددة لل ECM والخلايا الشحمية في تنظيم النسيج الدهني النمط الظاهري الأيضي. الانسجه الدهنية البشرية هي decellularized لعزل ECM ، والتي يتم أعاده ملؤها فيما بعد مع الخلايا الشحمية التي يتم بعد ذلك تمييزها داخل ECM إلى الخلايا الشحمية ناضجه. ينشئ هذا الأسلوب بنيات الخلايا الشحمية التي تعمل بالأيض وتحافظ علي خصائص الانسجه والمرضي الذين يتم اشتقاقهم منها. وقد استخدمنا هذا النظام لإثبات المرض محدده ECM-الخلية الشحمية المتبادلة في الانسجه الدهنية البشرية. يوفر نموذج الثقافة هذا أداه لتشريح ادوار ECM والخلايا الشحمية في المساهمة في النمط الظاهري الأيضي للانسجه الدهنية العالمية ويسمح بدراسة دور ECM في تنظيم توازن الانسجه الدهنية.
Introduction
مصفوفة خارج الخلية (ECM) لا يوفر فقط سقالة ميكانيكيه للانسجه ، ولكن أيضا يشارك في المتبادل معقده مع الخلايا التي تعيش داخلها ، وتنظيم العمليات المختلفة اللازمة للتوازن الانسجه ، بما في ذلك انتشار الخلايا ، التمايز ، والإشارات ، والأيض1. علي الرغم من ان ECM الصحي يلعب دورا أساسيا في الحفاظ علي وظيفة الانسجه الطبيعية ، فقد تورط في امراض متعددة2.
الانسجه الدهنية يلعب دورا هاما في التسبب في الامراض الايضيه. ويرتبط السمنة مع تضخم الخلايا الشحمية المفرطة ونقص الأكسجين الخلوي ، والعيوب في الأيض الخلوية الشحمية ، والانسجه الدهنية الشبكية إندوبلازمي والاكسده والتهاب. في حين سوء فهم, هذه العمليات المعقدة يتامرون لاضعاف المغذيات الانسجه الدهنية القدرة التخزين المؤقت, مما يؤدي إلى تجاوز المغذيات من الانسجه الدهنية, سميه في الانسجه المتعددة, وامراض الأيض الجهازية3,4 ،5. تسلسل الاحداث واليات المحددة التي تكمن وراء فشل الانسجه الدهنية غير مفهومه بشكل سيئ ، ولكن التعديلات في الانسجه الدهنية ECM قد تورطت. يتم تغيير تكوين ECM داخل الانسجه الدهنية في السمنة البشرية والمريدين ، مع زيادة ترسب بروتين ECM جنبا إلى جنب مع الاختلافات النوعية البيوكيميائية والهيكلية في الانسجه الدهنية ECM المرتبطة بالامراض الايضيه البشرية ، بما في ذلك النوع 2 من السكري والدهون6,7,8,9,10,11.
وعلي الرغم من هذه الملاحظات, دور الانسجه الدهنية ECM في التوسط الخلل الوظيفي الانسجه الدهنية ليست محدده جيدا. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود نماذج تجريبية عريكة تسمح بتشريح الأدوار المحددة لECM والخلايا الشحمية في تنظيم وظيفة الانسجه الدهنية النهائية. ثقافة ECM-الخلايا الشحمية يحاكي أفضل في بيئة الجسم الطبيعي من الانسجه الدهنية الاصليه في اثنين علي الأقل من النواحي. أولا ، توفر ثقافة ECM بيئة جزيئيه مماثله للانسجه الدهنية الاصليه ، بما في ذلك الانسجه الاصليه ، واللدائن ، وغيرها من البروتينات المصفوفة الغائبة في الثقافة ثنائيه الابعاد القياسية. ثانيا, وقد أظهرت الثقافة علي 2D البلاستيك لتغيير الأيض الخلايا الشحمية عن طريق الآثار الميكانيكية بسبب انخفاض مرونة الركيزة البلاستيك12, الذي ECM-الثقافة يلغي.
وقد درست أساليب لهندسه السقالات البيولوجية عن طريق عزل ECM من الدهون الدهنية وغيرها من الانسجه في سياق الطب التجديدي والترميمي وهندسه الانسجه13،14، 15،16،17،18. وقد نشرنا سابقا المنهجية التي قمنا بتكييف هذه الأساليب لتطوير نموذج 3D في المختبر من ثقافة الإنسان-الخلية الشحمية ، وذلك باستخدام ECM والخلايا الجذعية الخلية الشحمية المستمدة من الانسجه الدهنية البشرية الأحشاء11. في هذه المقالة ، نقوم بوصف هذه الأساليب بالتفصيل. اجراء التقطير للانسجه الدهنية البشرية هو عمليه لمده أربعه أيام التي تنطوي علي العلاجات الميكانيكية والانزيميه لأزاله الخلايا والدهون ، وترك سقالة البيولوجية التي تحافظ علي خصائص الانسجه التي تستمد منها. Decellularized ECM يدعم التمايز اديبوغينيك من الخلايا الشحمية البشرية ، وعند أعاده تشكيلها مع الخلايا الشحمية ، ويحافظ علي الهندسة المجهرية والخصائص البيوكيميائية والامراض الخاصة بالانسجه الدهنية سليمه ويشارك في الأيض وظائف مميزه من الانسجه الدهنية الاصليه. هذه المصفوفة يمكن دراستها وحدها أو أعاده الانفصال مع الخلايا ، والسماح بدراسة التفاعلات والتبادل بين المكونات الخلوية وخارج الخلوية من الانسجه الدهنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر نموذج ثقافة ECM-أديب أداه قيمه لتشريح الأدوار الفردية لECM والخلايا في إملاء النمط الظاهري الانسجه النهائية. وبروتوكول العزل الخاص بالنظام قابل للاستنساخ تماما ، ولكن يمكن ملاحظه التباين في عمليه التقطير. تعد خطوه اليوم الثالث الخاصة بالفصل نقطه حرجه في البروتوكول. عند الانتهاء من الا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر دانييل بيرغر ، مارلين وودروف ، سيمون كوريا ، و Retha Geiss للحصول علي المساعدة في تنسيق الدراسة. وقد تم تنفيذ SEM من قبل جامعه ميشيغان المجهر & تحليل الصور مختبر الطب الحيوي البحوث الاساسيه مرفق. تم دعم هذا المشروع من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01DK097449 (RWO) ، R01DK115190 (RWO ، CNL) ، R01DK090262 (CNL) ، وشؤون قدامي المحاربين منحه الجدارة I01CX001811 (RWO) ، الطيار ومنحه الجدوى من مركز ميشيغان لأبحاث السكري (منحه المعاهد القومية للصحة P30-DK020572) (RWO) ، أداره المحاربين القدماء VISN 10 سبارك التجريبية منحه (RWO). فحص المجهر الكتروني الذي تقوم به جامعه ميشيغان المجهر & تحليل الصور مختبر البحوث الطبية الحيوية مرفق الاساسيه. وقد نشر الشكل 4 من هذه المخطوطة في الأصل في بيكر وآخرون ، J Clin اندو Metab 2017 ؛ مارس 1 ؛ 102 (3) ، 1032-1043. doi: 10.1210/jc. 2016-2915 ، وقد استنسخ باذن من مطبعة جامعه أكسفورد [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. للحصول علي اذن لأعاده استخدام هذه المواد ، يرجى زيارة http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O’Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O’Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O’Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia’s effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
