Neutrale SO2 klynger af lav kinetisk energi (< 0,8 eV/constituent) bruges til desorb komplekse overflademolekyler som peptider eller lipider til yderligere analyse ved hjælp af massespektrometri ved hjælp af et ionfældemassespektrometer. Der kræves ingen særlig prøveforberedelse, og det er muligt at observere reaktioner i realtid.
Desorption/ionisering Induceret af neutrale SO2 Klynger (DINeC) anvendes som en meget blød og effektiv desorption/ioniseringsteknik til massespektrometri (MS) af komplekse molekyler og deres reaktioner på overflader. DINeC er baseret på en stråle af SO2 klynger, der påvirker prøveoverfladen ved lav klyngeenergi. Under klynge-overflade påvirkning, nogle af overfladen molekyler er desorberet og ioniseret via dissolvation i den påvirkende klynge; Som følge af denne dissol-medieret desorption mekanisme, lav klynge energi er tilstrækkelig, og desorption processen er meget blød. Både overflade adsorbater og molekyler, som overfladen er sammensat af kan analyseres. Der opnås klare og fragmenterede spektre fra komplekse molekyler som peptider og proteiner. DINeC kræver ingen særlige prøvepræparater, navnlig ingen matrix skal anvendes. Metoden giver kvantitative oplysninger om prøvernes sammensætning. molekyler ved en overfladedækning så lavt som 0,1 % af et monolag kan påvises. Overfladereaktioner såsom H/D-udveksling eller termisk nedbrydning kan observeres i realtid, og reaktionernes kinetik kan udledes. Ved hjælp af en pulserende dyse til klyngestrålegenerering kan DINeC effektivt kombineres med ionfældemassespektrometri. DINeC-processens matrixfrie og bløde karakter i kombination med ionfældens MSn-funktioner giver mulighed for meget detaljeret og utvetydig analyse af den kemiske sammensætning af komplekse økologiske prøver og organiske adsorbater på overflader.
Overfladefølsomme analyseteknikker er ofte baseret på partikelsonder som lavenergielektroner, atomer eller ioner, der i høj grad interagerer med faste prøver. Som følge heraf udviser de høj overfladefølsomhed, og detaljerede oplysninger om overfladekonstruktion kan fås1. Kemiske oplysninger er imidlertid ofte begrænsede. Som et eksempel kan røntgenfotoelektronspektroskopi give kvantitative oplysninger om den atomare sammensætning og om det gennemsnitlige kemiske miljø for en given art (f.eks. kulstofatomerne i et organisk molekyle, der adsorberedepå en overflade2). Det er dog vanskeligt at få mere detaljerede oplysninger om komplekse, overfladeadsorberede molekyler, såsom deres detaljerede struktur eller bindingssteder, med standardoverfladeanalyseteknikker. På den anden side vokser behovet for sådanne oplysninger med den stigende interesse for overfladefunktionalisering ved hjælp af organiske molekyler. De ekspanderende felter af on-overflade syntese3 eller overflade funktionalisering ved fastgørelse af biomolekyler4,5 er to fremtrædende eksempler. På alle disse områder undersøges grundlæggende spørgsmål om substrat-adsorbat- og adsorbat-adsorbatinteraktioner for bedre at forstå systemerne. I forbindelse med disse undersøgelser er det ønskeligt med højst oplysninger om adsorberede molekyler.
Til dels kan sekundær ion masse spektrometri (SIMS) give sådanne oplysninger. For det første er SIMS meget overfladefølsomme. For det andet, som sputtered adsorbater og deres fragmenter er opdaget ved hjælp af MS, oplysninger langt ud over atomare sammensætning er opnået. Afhængigt af arten af de kemiske arter adsorberet på overfladen, kan det identificeres ved sin molekylære masse og fragment mønster observeret i massespektret6. Fragmenterne induceret af de primære ioner faktisk kan hjælpe til identifikation af det analyserede materiale. Hvis den primære ion fremkaldte ændring (fragmentering, ioninducerede reaktioner, blanding) af prøven derimod er for stærk, går de fleste oplysninger om prøvens oprindelige tilstand tabt. Der er således gjort en stor indsats for at mindske fragmenteringen i SIMS (f.eks. ved hjælp af ladede molekylære klynger som primære ioner7,8,9). Men fragmentering stadig dominerer SIMS spektre af store makromolekyler og biologiske prøver10,begrænse anvendelsen af SIMS på forskellige områder.
Alternativt har vi vist desorption/ionisering forårsaget af neutrale klynger (DINeC) som en blød og matrixfri ioniseringsmetode, som med succes er blevet anvendt til massespektrometrisk analyse af komplekse molekyler11,12,13,14,15,16,17. DINeC er baseret på en stråle af molekylære klynger, som består af 103 til 104 SO2 molekyler (figur 1). Når klyngerne påvirker prøven, interagerer de på forskellige måder med molekylerne på og i overfladen: For det første omfordeles en del af klyngens kinetiske energi og aktiverer desorption. Tilsvarende vigtigt opløses desorbingmolekylet i klyngen under klyngeoverfladepåvirkning11,18,19 ( figur1 og figur 2). Med andre ord, baseret på den høje dipole øjeblik SO2, klyngerne meget effektivt tjene som en forbigående matrix for polære analysander. Som et resultat, desorption af analysand molekyler finder sted på klynge energier så lavt som 1 eV / molekyle og nedenfor. Den bløde karakter af desorptionsprocessen understøttes yderligere af hurtig afkøling af systemet , når SO2-klyngen splintres under og efter overfladepåkørsel11,19. Som en konsekvens af disse forskellige aspekter, klynge-induceret desorption af komplekse molekyler såsom peptider, proteiner, lipider, og farvestoffer provenuet uden nogen fragmentering af desorbing molekyler11,15; typiske massespektre viser den dominerende top ved m/z-værdien af det intakte molekyle ([M+H]+ eller [M-H]–figur 3). Afhængigt af antallet og arten af funktionelle grupper i molekylet, flere ladede kationer af formen [M + n· H]n+ er observeret11,15,18. For biomolekyler finder ionisering typisk sted via optagelse eller indvinding af en proton i en basis- eller sur funktionsgruppe, henholdsvis11. Hvis vandmolekyler er til stede i prøven, kan SO2 molekyler fra klyngen reagere med disse vandmolekyler, der danner svovlsyre18. Sidstnævnte kan fungere som en effektiv proton kilde, som yderligere fremmer ioniseringsprocessen i tilfælde af ionisering via proton optagelse (positiv ion mode)13,18.
Figur 1: Skematisk illustration af klynge-induceret desorption / ionisering og eksperimentel opsætning. Klynge-induceret desorption/ionisering udføres i en højvakuumbeholder. En stråle af SO2 klynger (gule prikker) er produceret via supersoniske udvidelse af en SO2/ Han gas blanding fra en pulserende dyse. Under klynge-overflade påvirkning, overflade molekyler er desorberet og ioniseret. Molekylære ioner (røde/orange prikker) overføres via et partisk gitter, et dobbelt iontragtindløb og octopolære ionguider i ionfælden for massespektrometri. Typiske massespektre viser dominerende toppe ved m/z-værdier af de intakte molekyler, her: M1 (orange) og M2 (rød) i positiv iontilstand. Spræng op: Under klyngeoverfladepåvirkningen opløses de besmittede molekyler i den nedslagsnde klynge eller et af dens fragmenter. Yderligere brud og fordampning af SO2 molekyler derefter føre til den nøgne, intakt molekylære ion som detekteret i massespektrometeret. Se også figur 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Øjebliksbilleder af molekylære dynamiksimuleringer, der illustrerer klynge-induceret desorption via dissolvation. (A) En SO2 klynge (300 molekyler) nærmer overfladen med 1250 m/s vinkelret på den overflade, hvor et dipeptid (aspartisyre-arginin, ASP-ARG) adsorbes. (B) Under påvirkning af klyngeoverfladen splintres klyngen. Adsorberet dipeptid interagerer med de omkringliggende SO2 molekyler, der fører til dens dissolvation i en af klyngefragmenterne. (C) Klyngefragmenterne frastødes fra overfladen. Det mærkede fragment (blå cirkel) bærer det dipeptid, der er desorberet i dette fragment. Dette tal er blevet ændret fra reference 19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativmassespektrum og molekylær model af angiotensin II. (A) Massespektre (toppanel: positiv iontilstand, bundpanel: negativ iontilstand) som opnået efter klyngeinduceret desorption/ionisering fra en angiotensin II-prøve. Prøven blev fremstillet ved drop-casting den respektive opløsning på en Si wafer (dækket af sin naturlige oxid). De vigtigste toppe er tildelt intakt biomolekyle, [M + H]+ og [M-H]–; der ikke observeres fragmenteringsmønstre. Dimers ([2M+H]+pil) angiver yderligere den bløde karakter af desorptionsprocessen. Det positive ionsignal er mere intenst på grund af indflydelsen fra SO 2-klyngerne18. (B) Rumfyldningsmodel og aminosyresekvens af angiotensin II. Hvide kugler indikerer brintatomer; sort: kulstof; blå: kvælstof; rød: ilt. Klik her for at se en større version af denne figur.
DINeC kan påføres enhver form for fast prøve, som er kompatibel med højvakuumforhold. Der kræves ingen særlig prøveforberedelse, navnlig ingen matrix, der skal anvendes før DINeC-MS-målinger, i modsætning til matrixassisteret laserdesorption/ionisering (MALDI) massespektrometri og beslægtede teknikker20,21. Dette muliggør realtidsmålinger af kemiske ændringer af prøven med varierende eksperimentelle forhold såsom baggrundstryk af reaktive arter i vakuumkammeret22 eller prøvetemperaturen. Detektionsgrænsen for DINeC-MS har vist sig at være i femtomoleområdet11. Når den anvendes på analyse af biomolekyler adsorberet på faste overflader i submonolayer regime, en overfladedækning så lavt som 0,1% af et monolag blev opdaget23. I denne dækningsordning afhænger signalintensiteten lineært af overfladedækningen, og DINeC-MS kan anvendes til kvantitativ analyse af overfladesammensætningen23. For blandede prøver er det muligt at foretage en kvantitativ vurdering af stikprøvesammensætningen17,24, da der ikke observeres nogen væsentlig indvirkning af det kemiske miljø på ioniseringssandsynligheden (f.eks. for blandede lipid-/peptidprøver17). Dette står i klar kontrast til SIMS, for hvilke ioniseringssandsynligheden for en given art typisk er stærkt påvirket af tilstedeværelsen af forskellige kemiske komponenter (den såkaldte “matrixeffekt”25,26).
Ud over overfladeanalyse kan kemisk sammensætning i undergrunden afundersøgtes ved hjælp af dybdeprofilering17. Med den nuværende opsætning, typiske desorption satser for klynge-induceret desorption af biomolekyler er af den rækkefølge 10-3 nm / s. En høj dybde opløsning i intervallet 1 til 2 nm er blevet observeret for blandet lipid / peptid prøver17.
Et andet anvendelsesområde er kombinationen af DINeC-MS med tyndt lagkromatografi (TLC). Konventionelle TLC-plader kan analyseres direkte ved hjælp af DINeC-MS. Positionsafhængige massespektre kan erhverves fra TLC-pladerne, og dermed massespecifikke kromatogrammer kan fås ved Hjælp af TLC-pladerne27. Det er ikke nødvendigt at reeluere de separerede analysatter , som er forskellig fra TLC i kombination med ENS28,29. Der kræves heller ingen matrix for DINeC-MS + TLC-kombinationen i modsætning til koblingen af TLC med MALDI28,29.
Desorption elektrospray ionisering (DESI) er også en blød desorption / ionisering metode til MS-applikationer30,31. De mest slående forskelle mellem DINeC og DESI er: DINeC23’skvantitative karakter , foreneligheden med ultrahøjvakuumforhold (UHV), navnlig muligheden for at undersøge prøver, der er tilberedt og overført under UHV-forhold, uden at bryde vakuum23,samt muligheden for effektivt at desorbuerikkepolære molekyler19.
I princippet kan DINeC som desorption/ioniseringskilde kobles til enhver form for massespektrometer. Kombinationen med ionfældemassespektrometri har imidlertid to hovedfordele: for det første pulsbredden og gentagelseshastigheden for en typisk pulserende klyngestråle svarer meget godt til den diskontinuerlige akkumuleringstid samt iontrapfældens spektralhastighed15,32. For det andet fører den bløde karakter af DINeC-processen til desorption af intakte molekyler. I kombination med msn kapaciteter ion fælde masse spektrometri, dette giver mulighed for en mest omfattende analyse af de undersøgte prøver15.
I mange undersøgelser, der hidtil er udført, er det påvist, at DINeC-MS er stor følsomhed over for forskellige stoffer. Faktisk giver dette mulighed for målinger af analysander ned til en mængde stof i femtomol regime11. På grund af denne høje følsomhed skal prøveforberedelse, navnlig substratrensning, udføres med meget rene kemikalier for at undgå kontaminering i DINeC-massespektre. Som det er tilfældet for mange analyseteknikker, hjælper en korrekt baggrundsmåling fra et tomt substrat med at adskille toppe fra analysanden og toppe, der har deres oprindelse i substrat-/prøveforberedelse.
Selv om vi har vist , at ioniseringssandsynligheden for et givet analysandmolekyle ikke er stærkt påvirket af tilstedeværelsen af coadsorbates eller medbestanddele i blandede prøver17,24, kan ioniseringssandsynligheden variere fra stof til stof13. Således er det endnu vigtigere at arbejde under rene forhold som forurenende stoffer, afhængigt af deres ionisering sandsynlighed, kan bidrage til signalet meget stærkere end analysanden. Prædannede ioner (f.eks. som findes i tilfælde af mange farvestofmolekyler) eller molekyler med funktionelle grupper, der viser en klar tendens til protonoptagelse eller deprotonation (dvs. baser eller syrer), viser typisk høj ioniseringssandsynlighed i DINeC-MS. Hvis en sådan funktionel gruppe ikke findes i analysanden, kan ioniseringssandsynligheden være lav. Prøverne kan derefter behandles ved ioniserende stoffer såsom trifluorsyre (f.eks. ved at eksponere prøven for ioniserende agensens damptryk).
De repræsentative resultater, der er beskrevet i figur 4 og figur 5, viser, at DINeC-MS finder anvendelse i realtid med henblik på realtidsundersøgelser af kemiske reaktioner ved hjælp af massespektrometri. Figur 6 illustrerer metodens submonolagsfølsomhed. Hvis de to egenskaber kombineres, kan kemiske reaktioner på overflader og deres produkter følges i realtid23. Dette kan især være af interesse for den såkaldte “on-surface syntese”, som fører til samling af makromolekylære strukturer på overflader3,33,34,35,36. I den nuværende opsætning er observation af sådanne overfladereaktioner mulig på overflader med lavere reaktivitet såsom guld23 og andre ædle metaller; forsøgene er vanskeligere at udføre på meget reaktive overflader såsom siliciumoverflader37,da grundtrykket i desorptionskammeret er i 10 -7-mbar-området. De nuværende aktiviteter tager højde for denne begrænsning, og der opbygges et UHV-kompatibelt DINeC-apparat. I tilfælde af reaktive overflader skal samspillet mellem SO2 og substratoverfladen testes forud for målinger af overfladeadsorbater og overfladereaktioner.
Da klyngestrålen er neutral, kan den ikke fokuseres. Strålestørrelsen på prøven angives således ved, at den i brug af udsnedsemaskinens opsætning og åbning er geometrisk. typiske værdier for strålediameteren på prøven er en til flere millimeter. Som et resultat, billeddannelse ved at scanne prøven er kun muligt med meget lav opløsning. På den anden side, givet af den høje ionisering sandsynlighed13, DINeC effektivt gør brug af de desorbede molekyler. Således synes en kombination af DINeC-MS og en ion-imaging detektor38 at være meget attraktiv.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender økonomisk støtte fra Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) og Helmholtz Graduate School for Hadron og Ion Research (PS). Forfatterne takker prof. Rauschenbach (University of Oxford) og hans team for frugtbart samarbejde om kombinerede ES-IBD/DINeC eksperimenter.
Acetone rotisolv HPLC | Roth | 7328.2 | HPLC Gradient Grade |
Copper tape | |||
Ethanol rotisolv HPLC | Roth | p076.1 | HPLC Gradient Grade |
Helium | Praxair | 4800086706 | Purity 99.9999% |
Nitrogen | Praxair | 40728408 | Purity 99.5 – 100% |
Silicon Wafers | Active Business Company GmbH | G60007 | |
Sulfur dioxide | Air Liquide | P1734S10R0A001 | Purity 99.98% |
Water rotisolv LC-MS | Roth | HN43.1 | Ultra LC-MS |