효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인
Summary
세균성 병원체는 중요한 생물학 프로세스를 표적으로 하는 호스트로 단백질을 은닉합니다. 세균성 이펙터 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로를 확인하는 것은 분자 병인을 해결하는 열쇠입니다. 여기서, 독성 세균 이펙터 단백질에 의해 표적화된 숙주 경로를 해명하기 위해 변형된 효모 억제기 및 독성 스크린을 사용하는 방법이 기재되어 있다.
Abstract
세포내 박테리아는 박테리아의 이익을 위해 숙주 단백질 및/또는 관련 생물학적 경로를 전복시키는 역할을 하는 숙주 시토솔로 이펙터 단백질이라고 불리는 독성 인자를 분비합니다. 세균 게놈 시퀀싱의 발전과 분비 후보및/또는 진핵을 코딩하는 유전자의 실리코 식별을 허용하는 알고리즘의 출현으로 인해 가용세균 이펙터 단백질의 식별이 더욱 관리가 용이해졌습니다. 도메인. 그러나, 이러한 중요한 독성 요인의 식별은 초기 단계에 불과합니다. 당연히, 목표는 이펙터 단백질의 분자 기능을 결정하고 호스트와 상호 작용하는 방법을 밝히는 것입니다. 최근 몇 년 동안, 질량 분석과 결합된 효모 2 하이브리드 스크린 및 대규모 면역 침전과 같은 기술은 단백질 단백질 상호 작용의 확인에 원조되었습니다. 숙주 결합 파트너의 식별이 세균 효과 단백질의 분자 기능을 해명하는 중요한 첫 번째 단계이지만, 때로는 숙주 단백질이 여러 생물학적 기능 (예를 들어, 액틴, 클라트린, 튜불린) 또는 세균성 단백질은 호스트 단백질을 물리적으로 묶지 않을 수 있습니다, 조작되는 정확한 호스트 통로에 관하여 중요한 정보의 연구원을 박탈하. 서프레서 스크린과 결합된 변형된 효모 독성 스크린은 세균 효과 단백질에 의해 영향을 받는 숙주 경로를 식별하도록 조정되었습니다. 독성 스크린은 종종 성장 결함으로 명시되는 숙주 생물학적 경로를 방해하는 이펙터 단백질에 의한 효모의 독성 효과에 의존한다. 효모 게놈 라이브러리의 발현은 세균 이펙터 단백질의 독성을 억제하는 숙주 인자를 식별하고 따라서 이펙터 단백질이 표적으로 하는 경로내의 단백질을 식별하는 데 사용된다. 이 프로토콜에는 독성 및 억제기 스크린에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다. 이러한 기술은 효모 및 대장균의분자 복제 및 재배가 가능한 모든 실험실에서 수행 될 수 있습니다.
Introduction
여기에 제시된 것과 유사한 절차의 첫번째 보고는 레지오넬라 성 균 타입 IV 이펙터 SidD, Rab11을수정하는 deAMPylase를 특징으로 합니다. 유사한 기술은 여러 L. 폐렴 구이펙터 1,2,3의특성화에 사용되었다. 상기 분석법은 콕시엘라 버네티형 IV 이펙터 단백질4를특성화하도록 적용되었으며, 최근에는 클라미디아 트라코마티스 함유 막 단백질의 특성화를 위해 이 기술의 유용성이 확대되었다5 .
이 프로토콜은 두 가지 주요 부분으로 나눌 수 있습니다: 1) 효모 독성 스크린, 관심 있는 세균 효과 단백질은 효모에서 발현 되고 클론은 성장 결함에 의해 입증된 바와 같이 독성 표현형을 위해 스크리핑되고, 2) 효모 억제기 스크린 , 독성 표현형이 독성 균주에서 효모 게놈 라이브러리의 발현에 의해 억제되는 경우. 따라서, 독성 화는 관심 있는 세균 효과제가 과발현될 때 성장 결함으로 나타나는 독성 표현형에 대한 스크린이다. 세균 이펙터를 성공적으로 변형하고 표현한 독성 클론이 다음 단계를 위해 선택되고 저장됩니다. 두 번째 주요 단계는 독성 효모 클론에서 부분적으로 소화 된 효모 게놈 라이브러리를 과발현하는 것을 포함합니다. 이 프로토콜에서 사용하기 위해 제안된 효모 게놈 라이브러리를 구성하는 플라스미드는 5-20kb 인서트를 가지고 있으며, 일반적으로 모든 플라스미드에서 평균 유전자 크기의 3-13 효모 개방 판독 프레임(ORF)에 해당하며, 전체 효모 게놈을 나타냅니다. 약 10배. 분석의 이 부분은 세균성 이펙터 단백질의 독성을 억제하는 것이 목적이기 때문에 서프레서 스크린이라고 합니다. 전위 억제기 플라스미드는 효모로부터 분리되고, 시퀀싱되고, 식별된 억제 ORFs로부터 분리된다. 서프레서 스크린의 근본적인 근거는 이펙터 단백질이 대상호스트 통로의 성분과 결합, 상호 작용 및/또는 압도하며, 이러한 숙주 단백질을 과도하게 제공하면 경로에 대한 독성 효과를 구출할 수 있다는 것입니다. 성장 결함. 따라서, 독성을 억제하는 확인된 ORF는 종종 숙주 통로의 여러 참가자를 나타낸다. 직교 실험은 세균이 실제로 연루 된 통로와 상호 작용하는지 확인하기 위해 수행됩니다. 이것은 이 단백질이 호스트 프로세스의 다수에서 관련되기 때문에, clathrin 또는 actin와 같은 결합 파트너가 확인된 경우에 특히 필요합니다. 추가 실험은 감염 도중 이펙터 단백질의 생리기능을 해명할 수 있다. 독성 및 억제제 스크린은 또한 면역 침전에 의해 검출하기에 충분한 친화력으로 숙주 단백질을 물리적으로 결합하지 않거나 상호 작용하는 세균 효과 단백질의 생리적 기능을 해독하기 위한 강력한 도구입니다. 효모 2 하이브리드 화면에 의해 감지되지 않을 수 있는 효소 적중 및 실행 상호 작용의 호스트.
서프레서 스크린은 세균 효과단백질과 숙주 경로 사이의 잠재적인 생리적 상호작용을 드러내는 강력한 방법이 될 수 있지만, 세균 이펙터 단백질은 효모에서 성장 결함을 유도해야 하며, 그렇지 않으면 이를 사용하여 서프레서 화면은 거의 사용되지 않습니다. 더욱이, 독성 표현형은 적어도 2-3 log10 의 성장을 초래해야 하거나 억제기를 식별하기 어려울 것이다. 실험실이 세포 배양을 위해 설치되는 경우에, HeLa와 같은 일반적인 세포주에서 독성을 위한 스크리닝 이펙터 단백질은 종종 효모 독성 스크린을 진행하기 위하여 노력가치가 있는지에 대한 통찰력을 줄 수 있습니다. HeLa 세포에서 이펙터 단백질의 자궁내 발현은 때때로 이들 스크린에 사용되는 효모 균주에서 독성과 매우 강하게 상관되는 독성을초래한다 4. HeLa 세포에 있는 긴장의 관찰가능한 특징은 긴장 섬유의 손실, 격판덮개에서 세포 분리 및 apoptosis를 나타내는 핵 응축을 포함합니다. HeLa 세포에 있는 긴장의 어떤 시각적인 표시든지 관심의 단백질은 효모에 있는 성장 결함을 유도하기 위한 좋은 후보를 만듭니다, 이는 훨씬 더 급속하게 복제하고 따라서 필수적인 통로의 교란에 더 반응합니다.
서프레서 스크린이 항상 호스트 바인딩 파트너를 억제자로 식별하지는 않지만 대상 호스트 경로의 중요한 구성 요소를 연루할 수 있으므로 세균 효과 단백질. 표면적으로, 이것은 이펙터 단백질의 결합 파트너를 과도하게 제공하면 성장 결함을 구출할 것으로 예상되기 때문에 직관적이지 않은 것으로 보인다. C. 트라코마티스 이펙터 단백질 CT229(CpoS)에 의해 표적화된 경로를 식별하기 위한 노력의 일환으로, 이는 감염 시 적어도 10개의 상이한 랍 GTPases에결합5,Rab 결합 파트너 중 누구도 CT229의 독성을 억제하지 않았다. 그러나, clathrin 코팅 소포 (CCV) 인신 매매에 관련 된 수많은 억제기 확인 되었다, CT229 특히 Rab 의존 CCV 인신 매매를 전복 하는 추가 작업을 주도. 유사하게, C. burnetii 이펙터 단백질 Cbu0041 (CirA)를 조사할 때 효모 성장 결함을 구출한 몇몇 Rho GTPases가 확인되었고, 나중에 RhoA4에대한 GTPase 활성화 단백질(GAP)으로서 CirA가 기능한다는 것을 발견하였다.
세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 숙주 통로를 해명하기 위한 효모 억제기 스크린의 유용성은 과장될 수 없고, 세포내 세균성 이펙터 단백질을 특성화하는 것을 시도하는 그밖 연구원은 크게 에서 유익할 수 있습니다 이러한 기술. 이 분석실험은 면역침전 및/또는 효모 2개의 하이브리드 스크린이 결합 파트너를 찾아내지 못하고 어떤 통로가 세균성 이펙터 단백질에 의해 표적으로 하는지 해명할 수 있는 경우에 가치가 있습니다. 여기서, 세포내 세균 효과기 단백질에 의해 표적으로 된 숙주 생물학적 경로를 확인하기 위한 독성 및 억제기 스크린에 대한 상세한 프로토콜이 제공되며, 이러한 분석및 이들의 분석및 이들의 사용 시 경험되는 일반적인 장애물들 중 일부가 제공된다. 해당 솔루션을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 변형된 효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 기 단백질에 의해 표적으로 하는 호스트 생물학 통로를 확인하기 위한 단계별 절차를 설명합니다. 사용되는 효모 균주, S. 세레비시아 W303은 우라실과 류신 모두에 대한 보조 영양입니다. 유라실 보조축은 류신 보조증이 효모 게놈 라이브러리 벡터 pYep13을 선택하기 위해 사용되는 동안 류신 보조증이 사용되는 동안 pY…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이러한 기술에 도움을 준 셸비 앤더슨, 애비 맥컬로프, 로렐 우즈에게 감사드립니다. 이 연구는 메리 M. 웨버에 미생물학 및 면역학의 아이오와 대학에서 시작 자금에 의해 투자되었다.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
- Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
- Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
- Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
- Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
- Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
- Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
- Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
- Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
- Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
- Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
- Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
- Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).
