Elektrovåd-baserede digitale mikrofluidic er en teknik, der udnytter en spændingsdrevet ændring i den tilsyneladende kontaktvinkel af en mikroliter-volumen dråbe for at lette sin manipulation. Ved at kombinere dette med funktionaliserede magnetiske perler kan integration en af flere laboratorieenheder operationer for prøve forberedelse og identifikation af patogener ved hjælp af enzym-forbundet Immunosorbent Assay (ELISA).
Elektrofugter er den virkning, hvorved kontaktvinklen på en dråbe, der udsættes for en overfladeladning, ændres. Elektrowetting-on-dielectric (EWOD) udnytter de dielektriske egenskaber af tynde isolatorfilm for at forbedre ladningstætheden og dermed øge elektrowettingeffekten. Tilstedeværelsen af ladninger resulterer i en elektrisk induceret spredning af dråbe, som tillader målrettet manipulation på tværs af en hydrofob overflade. Her demonstrerer vi EWOD-baseret protokol for prøvebehandling og påvisning af fire kategorier af antigener ved hjælp af en automatiseret overfladeaktiveringsplatform via to variationer af en Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) metoder. ELISA udføres på magnetiske perler med immobiliserede primære antistoffer, som kan vælges til at målrette et bestemt antigen. Et antistof konjugeret til HRP binder sig til antigenet og blandes med H2O2/Luminol til kvantificering af de tilfangetagne patogener. Assay færdiggørelsestider på mellem 6 og 10 min blev opnået, mens små mængder af reagenser blev udnyttet.
Den foreslåede metode har til formål at lette automatiseret prøveforberedelse til ELISA med kvantitativ påvisning af antigener ved hjælp af EWOD-baseret tilgang med digital mikrofluidik (DMF) og magnetophoretisk adskillelse. Det er blevet påvist for flere biologiske anvendelser, at DMF i kombination med magnetophoresis er et interessant alternativ til væskehåndtering applikationer1. Mere specifikt er påvisning af patogener et implicit aspekt i mange sektorer, lige fra sundhedspleje2 til landbrug og miljø3,4 til national sikkerhed5. En detektionsteknologi, der kan håndtere truslerne fra patogener, skal have et højt gennemløb (f.eks. kort analysetid), effektivitet (lav detektionsgrænse – LoD – og høj følsomhed) og specificitet (til målpatogentypen), for at den kan være funktionel6.
Tidligere, EWOD-baserede DMF er blevet gennemført med succes for Reverse Transskription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), påvisning af en antibiotika-resistent patogen (Methicillin-resistente Staphylococcus aureaus eller MRSA), M.pneumonia og C.albicans ved hjælp af et lavt budget, print-print-print-print chip og magnetophoresis7. Teknikken blev også anvendt til påvisning af deoxyribonucleic syre (DNA) mutationer gennem pyrosequencing og chemiluminescerende detektion8. EWOD-baserede platforme udvider også deres funktionalitet til immunassayapplikationer, hvilket muliggør samtidig prøvegenvinding og påvisning af alle inden for en enkelt, integreret platform. For eksempel, en enkelt EWOD-chip design blev påvist med succes med en DMF platform for point-of-care test for både perle-baserede immunassays af hjerte troponin I fra en fuldblodsprøve og som et separat eksperiment RT-PCR for MRSA påvisning2. Denne chip udnytter olie fyldstof, som forhindrer fordampning af dråberne og letter pålidelig automatiseret manipulation af nanoliter mængder. Alsidige bioapplikationer blev undersøgt med gennemførelsen af lignende DMF-tilgange, der dækker kvantitative homogene og heterogene immunassays9,10 herunder design af eksperimenter (DoE) undersøgelser for analyse parameter optimering11.
På trods af dens åbenlyse fordele ved at behandle intensivering på grund af minimale arbejdsmængder kan en oliefyldt DMF-platform være udfordrende og kræver en vis grad af ekspertise for at fungere. Oliefyldte systemer, fordi de kræver forseglet komponent, er ikke ideelle til sikker anvendelse i marken, hvor systemets transportbarhed er vigtig. Desuden ville et oliebaseret system være meget vanskeligt, hvis ikke umuligt at anvende til visse specifikke anvendelser, der udnytter indsamling af tørt materiale på en overflade som foreslået af Zhao og Cho12, Jönsson-Niedziółka et al.13og Foat et al.14. I modsætning hertil er oliefrie systemer enkle at integrere og har den fordel, at de giver nem chip-to-chip-prøveoversættelse. Af disse grunde blev den foreslåede metode udviklet til at give en EWOD-baseret immunassay på DMF, som ikke ville kræve olie, effektivt at forenkle enhedens drift.
I dette bidrag rapporterer vi om brug af en skræddersyet, fritstående, fuldt automatiseret DMF-platform til immunassays, og vi uddyber protokollen for hurtig påvisning af biomolekyler, nemlig: proteiner, vegetative bakterier, bakteriesporer og vira. Kombinationen af EWOD-chip med magnetiske partikler til automatiseret prøveforberedelse og immunudfældning er allerede blevet påvist med en yderligere off-line MS-måling15. For nylig, in-field diagnostiske mod mæslinger og røde hunde IgG er blevet påvist i fjerntliggende nordvestlige Kenyas befolkning af Wheeler gruppe16. Både Wheeler’s og vores system, er transportable, selvstændig, fuldautomatisk med inkluderet on-chip, real-time chemilumineescerende målinger er velsagtens blandt de mest avancerede DMF biodetektionssystemer til rådighed.
De to systemer er designet med meget forskellige applikationer i tankerne. Wheelers system er rettet mod biomarkør for at tillade biomedicinsk diagnostik på patienter, mens vores biodetektionssystem er bygget op omkring forsvarskrav til direkte påvisning af patogen, der tidligere blev udtaget fra luft. Ligheden mellem de to er det underliggende princip om droplet aktivering, som viser den brede vifte af livspåvirkende sektorer, at EWOD-baserede teknologi kan påvirke. Nemlig, dMF-baserede detektionsplatform og tilhørende EWOD-system kunne finde vigtige konsekvenser i sundhed (biomedicinsk diagnostiske); militær og civil beskyttelse (trusselsafsløring) Landbrugsteknologi (afgrødeovervågning) og arbejdssikkerhed (kontrolleret miljøovervågning)
Udførelsen af vores DMF platform vurderes mod fuldautomatisk påvisning af humanserum albumin (HSA, en kugleformet protein), Escherichia coli (E. coli, en vegetativ bakterier), Bacillus atrophaeus (BG, en bakteriel spore) og MS2 (en bakteriofhage virus). Endnu vigtigere er, den foreslåede DMF-metode er yderst alsidig i den forstand, at fange antistoffer kunne udveksles til at målrette påvisning af andre antigener forskellig fra de fire, der betragtes i denne artikel. Sidestepping antistof-baserede sensing helt, DMF platform kunne bygge til en potentiel anvendelse baseret på aptamer biosensing, hvor de magnetiske perler bære specifikke aptamers til fangst og / eller påvisning af nukleotider. Udformningen og realiseringen af de forskellige komponenter, der udgør den integrerede, helt selvstændig DMF platform, herunder højspænding bølgeform generator og drev elektronik oplyses andetsteds6.
EWOD-immunassayprotokollen er fleksibel og kan omfatte et forskelligt antal laboratorieenheders operationer (f.eks. opsamlingsantigen, blanding, inkubation, perleekstraktion, vask) afhængigt af reagenstype, stabilitet og brugskrav, der er defineret i analyseprotokollen. Som et principbevis overvejes to immunoassayprotokoller i den nuværende artikel, der viser gennemførelsen af otte eller ti LUOs(figur 4) med den beskrevne EWOD-chip. En sådan miniaturisering fortjener mikroliter, diskrete mængder reagenser/analysand, der øger ELISA’s effektivitet ved at reducere både forbruget af reagenser, den tid, der kræves pr. operation, i det væsentlige den samlede forsøgstid (6 til 10 min). Endvidere, analysen er automatiseret med tidsberegnet manipulation af dråberne, som nedsætter variationer og forbedrer præcisionen af immunassay17. I sit nuværende format indebærer eksperimentet manuel håndtering af dråber i begyndelsen af hver analyse, hvilket er et punkt for yderligere diskussion i næste afsnit.
Et kritisk skridt i den nuværende DMF metode er at dispensere dråberne på overfladen af EWOD chip. Typisk bruges en mikropipette med engangsspids til at måle den nøjagtige volumen og indlæse den. Det kan dog blive en udfordring at immobilisere dråben på den hydrofobe overflade af aktiveringspladen på grund af interaktioner mellem dråbeog den ladede overflade af engangsspidsen. Som et resultat, kan dråbe skyde op efter den ydre overflade af spidsen i stedet for at forblive på pladen. For at undgå dette skal mikropipette holdes i opretstående stilling, vinkelret på spånoverfladen uden at røre ved den, og derefter kan dråben dispenseres på læsserampen ved at bringe den i kontakt med overfladen. Hvis dråbepinden klæber til pipettespidsen, skal du returnere den til børsløsningen, udskifte spidsen og gendeponere en frisk dråbe. I en videreudvikling af det nuværende proof-of-concept-system kan der overvejes automatisk levering af dråbe.
Et andet kritisk skridt, før du kører analysen, er at lukke låget af den parallelle plade samling. Som tidligere nævnt i protokollen skal låget skubbes oven på aktiveringspladen. Lågets hydrofobe overflade forhindrer forvrængning og forskydning af de dråber, der sidder på aktiveringspladen. For at sikre en jævn bevægelse af dråben anbefales det på det kraftigste at bruge uberørt aktiveringsplade, korrekt belastning af dråberne og spånsamlingen. Det er muligt at genbruge aktiveringspladerne. Antallet af cyklusser afhænger dog af aktiveringsspændingerne (figur 3) og analytten/reagensen, der aflejres på overfladen, også kaldet biofouling. Den præsenterede platform udnyttede kromtrykt EWOD-chip, som kunne genbruges pålideligt til på hinanden følgende målinger op til fire gange ved driftsspænding på 120 V og mellemliggende pladerensning efter hvert eksperiment. Pladerne blev genbrugt for at reducere omkostningerne pr. forsøg ved at dekontaminere (børste overfladen med ufortyndet rengøringsmiddel før grundigskylning) de biofouled amorfe fluorpolymerer (Materialetabel)belægning og spin-belægning en frisk oven på pladen. Genvindingspladegenbrug kræver dog manuel håndtering, dyre reagenser (amorfe fluorpolymerer (materialetabel))og specialiseret udstyr (spin-coater). Alternative EWOD-chips undersøges med succes med omkostningseffektive underlag såsom papir19, acetatfilm eller trykte kredsløb (PCB)20,21. Sådanne engangsforbrugsstoffer kan lette pålidelig og økonomisk overkommelig brug af DMF-platformen og kan give midler til at omgå biofouling-problemet.
Biofouling er den vigtigste begrænsning af EWOD for biologiske anvendelser22,23. Tidligere undersøgelser af DMF har identificeret to mekanismer, der bidrager til biofouling, nemlig passiv adsorption på grund af hydrofobe interaktioner, og en elektrostatisk drevet adsorption manifesterer sig, når et elektrisk felt anvendes24. Resultaterne i den aktuelle artikel er i overensstemmelse med denne teori, da det blev dokumenteret aktivering plade genanvendelighed falder ved høj aktivering spændinger. En mulig forklaring er, at proteiner adsorb let på Fluoropolymer-belagte (Teflon-lignende) overflader, og de samles hurtigere på fouled i forhold til uberørte overflader24. Som følge heraf er proteinrelaterede analyser på DMF svære at kvantificere og kan opleve tab af analysand, krydskontaminering og formindsket præcision17. Det værst tænkelige scenario er, når en kritisk mængde af protein adsorber dermed gøre enheden ubrugelig. For at minimere biofouling, forskellige tilgange er blevet undersøgt fra at minimere opholdstiden for dråben på chippen, gennem belægninger23,til tilsætningsstoffer (dvs. overfladeaktive stoffer eller pluroonsyre) i biomateriale-laden dråber6,22. Derfor et vigtigt aspekt af immunassay assay på EWOD er at vælge anti-biofouling strategier, der er forenelige med den specifikke protokol ved hånden.
Den automatiserede DMF-platform er designet til at udføre en enkelt sandwich ELISA-test pr. kørsel, mens der anvendes mikrolitervolumen til både reagenser og analysand. Når det er påkrævet, findes konventionelle sandwich ELISA kits baseret på forbelagte 96-brønd eller 384-brøndplader, der i kombination med hjælpelaboratorieudstyr resulterer i højere gennemløb pr. kørsel; baseret på reagenspris, er de omtrentlige omkostninger pr. analyse/brønd 6,04 USD (580 USD/96) og 0,33 USD (2×580 USD/384). Dette gør de konventionelle ELISA-metoder ideelle til et stort antal prøver, der typisk behandles af uddannet teknisk personale på centraliserede laboratoriefaciliteter. På fjerntliggende steder viste elisa’s detaljerede omkostningsanalyse for miljøovervågning imidlertid, at da kapitalomkostningerne (dvs. laboratoriedriftsomkostninger, tilbagevendende omkostninger, prøvetransport, forsyninger og personale) blev medtaget, var den faktiske pris pr. ELISA på 60 USD, hvoraf 34 USD var til levering pr. stikprøve25. I modsætning hertil er den foreslåede DMF platform bærbar, kræver minimal uddannelse til at fungere og med pre-belagte perler kan give prøve-til-svar analyse på få minutter. Derfor kan den præsenterede teknologi anvendes til point-of-need steder og supplere analyser, der ellers findes i centraliserede laboratorier.
I afsnittet med repræsentative resultater blev den automatiserede DMF-immunassayplatform brugt til direkte påvisning af patogener til forsvarsanvendelse. Andre mulige anvendelser af DMF-platformen omfatter, men er ikke begrænset til, biodiagnostisk, kontinuerlig overvågning og automatiseret prøveudtagning. Potentielt DMF kunne påvirke forskellige sektorer fra punkt-of-pleje til personlig sundhedspleje, samt kontrolleret miljøovervågning til beskyttelse af patienter fra luftbårne Hospital Erhvervet Infektion, til afgrøde overvågningssystem for landbrug og fødevareproduktion.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende bidraget fra vores kolleger fra Microfluidic & Microengineering Research Group for deres arbejde med mekanisk design og systemintegration. Forfatterne vil gerne takke Dstl Porton Down for deres uvurderlige støtte og finansielle bidrag til tidligere og igangværende projekter, der videreudvikler DMF-teknologien og dens anvendelser.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |