Microfluidico digitale basato sull’elettrowetting è una tecnica che utilizza un cambiamento basato sulla tensione nell’angolo di contatto apparente di una goccia di microlitro-volume per facilitarne la manipolazione. La combinazione di questo con perline magnetiche funzionalizzate consente l’integrazione di più operazioni di unità di laboratorio per la preparazione del campione e l’identificazione di agenti patogeni utilizzando Immunosorbent Assay (ELISA) legato all’enzima.
L’elettroumidità è l’effetto con cui viene modificato l’angolo di contatto di una goccia esposta a una carica di superficie. L’elettrowetting-on-dielectric (EWOD) sfrutta le proprietà dielettriche delle pellicole isolanti sottili per aumentare la densità di carica e quindi aumentare l’effetto di elettromutazione. La presenza di cariche si traduce in una diffusione elettricamente indotta della goccia che consente una manipolazione mirata su una superficie idrofobica. Qui, dimostri il protocollo basato su EWOD per l’elaborazione dei campioni e il rilevamento di quattro categorie di antigeni, utilizzando una piattaforma di riutilizzo automatica della superficie, tramite due varianti di un metodo ELISA (ELISA) di Immunosorbent Assay (ELISA) legato all’enzima. L’ELISA viene eseguito su perline magnetiche con anticorpi primari immobilizzati che possono essere selezionati per colpire un antigene specifico. Un anticorpo coniugato all’HRP si lega all’antigene ed è mescolato con H2O2/Luminol per la quantificazione degli agenti patogeni catturati. Sono stati raggiunti tempi di completamento del saggio compresi tra 6 e 10 min, mentre sono stati utilizzati minuscoli volumi di reagenti.
Il metodo proposto mira a facilitare la preparazione automatizzata dei campioni per ELISA con rilevamento quantitativo di antigeni utilizzando l’approccio basato su EWOD con microfluidica digitale (DMF) e la separazione magnetoforetica. È stato dimostrato per molteplici applicazioni biologiche che la DMF in combinazione con la magnetoforesi è un’interessante alternativa alle applicazioni di movimentazione liquida1. Più specificamente, la rilevazione di agenti patogeni è un aspetto implicito in molti settori, che vanno dall’assistenza sanitaria2 all’agricoltura e all’ambiente3,4 alla sicurezza nazionale5. Una tecnologia di rilevamento in grado di affrontare le minacce provenienti dagli agenti patogeni deve presentare un alto livello di produttività (ad esempio il tempo di analisi breve), l’efficienza (basso limite di rilevamento – LoD – e alta sensibilità) e la specificità (al tipo di agente patogeno di destinazione) affinché sia funzionale6.
In precedenza, il DMF basato su EWOD è stato implementato con successo per la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR), rilevamento di un patogeno resistente agli antibiotici (Staphylococcus aureaus resistente alla meticillina o MRSA), M.pneumonia e C.albicans utilizzando una scheda a circuito stampato a basso budget e magnetoforesi7. La tecnica è stata applicata anche per la rilevazione di mutazioni di acido deossiribonucleico (DNA) attraverso il pirosncing e il rilevamento chemiluminescente8. Le piattaforme basate su EWOD ampliano anche le loro funzionalità verso applicazioni di immunoanalisi, consentendo così il recupero e il rilevamento simultanei dei campioni all’interno di un’unica piattaforma integrata. Per esempio, un singolo progetto di chip EWOD è stato dimostrato con successo con una piattaforma DMF per test point-of-care sia per immunoassays a base di perline di troponina cardiaca I da un intero campione di sangue e come esperimento separato RT-PCR per il rilevamento MRSA2. Questo chip utilizza il riempitivo di olio, che impedisce l’evaporazione delle goccioline e facilita la manipolazione automatizzata affidabile dei volumi di nanollitri. Sono state studiate bioapplicazioni versatili con l’implementazione di simili approcci DMF che coprono immunoasdice quantitativi omogenei ed eterogenei9,10 inclusi studi di progettazione di esperimenti (DoE) per l’ottimizzazione dei parametri di analisi11.
Nonostante i suoi ovvi meriti di elaborare l’intensificazione a causa di piccoli volumi di lavoro, una piattaforma DMF piena di petrolio può essere impegnativa e richiede un certo livello di competenza per operare. I sistemi riempiti di petrolio, poiché richiedono componenti sigillati, non sono ideali per alcune applicazioni sul campo in cui la trasportabilità del sistema è importante. Inoltre, un sistema a base di olio sarebbe molto difficile se non impossibile da usare per alcune applicazioni specifiche che sfruttano la raccolta di materiale secco su una superficie come proposto da shao e Cho12, J ‘nsson-Niedzi’ka et al.13, e Foat et al.14. Al contrario, i sistemi senza olio sono semplici da integrare e hanno il vantaggio di fornire una facile traduzione campione chip-to-chip. Per questi motivi, il metodo proposto è stato sviluppato per fornire un’immuno-unità di prova a base di EWOD su DMF che non richiederebbe petrolio, semplificando efficacemente il funzionamento del dispositivo.
In questo contributo, riportiamo l’utilizzo di una piattaforma DMF su misura, indipendente e completamente automatizzata per gli immunoasisti, ed elaboriamo il protocollo per il rilevamento rapido di biomolecole, vale a dire: proteine, batteri vegetativi, spore batteriche e virus. La combinazione di eWOD-chip con particelle magnetiche per la preparazione automatizzata del campione e l’immunoprecipitazioni è già stata dimostrata con un’ulteriore misurazione della SM off-line15. Recentemente, la diagnostica sul campo contro il metales e la rosolia IgG è stata dimostrata nella remota popolazione del Kenya nordoccidentalo dal gruppo Wheeler16. Sia Wheeler che il nostro sistema, essendo trasportabili, autonomi, completamente automatizzati con misurazioni chemiluminescenti in tempo reale incluse sono probabilmente tra i sistemi di biorilevamento DMF più avanzati disponibili.
I due sistemi sono stati progettati tenendo presenti applicazioni molto diverse. Il sistema di Wheeler si rivolge ai biomarcatori per consentire la diagnostica biomedica sui pazienti, mentre il nostro sistema di biorilevamento è costruito intorno al requisito di difesa per il rilevamento diretto di patogeni precedentemente campionati dall’aria. La somiglianza tra i due è il principio di base dell’attuazione delle goccioline, che dimostra l’ampia gamma di settori che influenzano la vita su cui la tecnologia basata sull’EWOD può avere un impatto. Vale a dire, la piattaforma di rilevamento basata su DMF e il sistema EWOD associato potrebbero trovare implicazioni chiave nella salute (diagnostica biomedica); protezione militare e civile (rilevamento delle minacce); Agri-tecnologia (monitoraggio delle colture) e sicurezza sul lavoro (monitoraggio controllato dell’ambiente)
Le prestazioni della nostra piattaforma DMF sono valutate contro il rilevamento completamente automatizzato dell’albumina del siero umano (HSA, una proteina globulare), l’Escherichia coli (E. coli, un batterio vegetativo), Bacillus atrofeo (BG, una spore batterica) e MS2 (un virus batteriophage). Ancora più importante, il metodo DMF proposto è estremamente versatile nel senso che gli anticorpi di cattura potrebbero essere scambiati per mirare al rilevamento di altri antigeni diversi dai quattro che sono considerati in questo articolo. Superando completamente il rilevamento basato su anticorpi, la piattaforma DMF potrebbe essere basata su una potenziale applicazione basata sul biosensing degli aptameri, dove le perline magnetiche trasportano aptamers specifici per la cattura e/o il rilevamento dei nucleotidi. La progettazione e la realizzazione dei diversi componenti che costituiscono la piattaforma DMF integrata e completamente autonoma, tra cui il generatore di forma d’onda ad alta tensione e l’elettronica di azionamento sono divulgati altrove6.
Il protocollo di immunoanalisi EWOD è flessibile e può includere un numero elevato di operazioni di unità di laboratorio (ad esempio, antigene di cattura, miscelazione, incubazione, estrazione del tallone, lavaggio) a seconda del tipo di reagente, della stabilità e dei requisiti di utilizzo definiti dal protocollo di analisi. Come prova di principio, nell’articolo attuale, vengono considerati due protocolli di immunoanalisi che mostrano l’implementazione di otto o dieci LUO (Figura 4) con il chip EWOD descritto. Tale miniaturizzazione merita dal microlitro, volumi discreti di reagenti/analiti che aumentano l’efficacia dell’ELISA riducendo sia il consumo di reagenti, il tempo richiesto per operazione, essenzialmente, il tempo totale di tempo sperimentale (6 a 10 min). Inoltre, il test è automatizzato con la manipolazione a tempo delle goccioline che diminuisce le variazioni e migliora la precisione dell’immunoaspo17. Nel suo formato attuale, l’esperimento prevede la gestione manuale delle goccioline all’inizio di ogni saggio, che è un punto per ulteriori discussioni nella sezione successiva.
Un passo critico nell’attuale metodo DMF è l’erogazione delle goccioline sulla superficie del chip EWOD. Tipicamente, una micropipetta con una punta usa e getta viene utilizzata per misurare il volume esatto e per caricarlo. Tuttavia, può diventare difficile immobilizzare la goccia sulla superficie idrofobica della piastra di attuazione a causa delle interazioni tra la gocciolina e la superficie carica della punta usa e getta. Di conseguenza, la goccia può sparare seguendo la superficie esterna della punta invece di rimanere sul piatto. Per evitare questo, la micropipetta deve essere tenuta in posizione eretta, perpendicolare alla superficie del chip, senza toccarla, quindi la goccia può essere erogata alla rampa di carico portandola a contatto con la superficie. Se la gocciolina si attacca alla punta della pipetta, restituiscla alla soluzione di magazzino, scambia la punta e rideposita una goccia fresca. In un ulteriore sviluppo dell’attuale sistema proof-of-concept, si può prevedere la consegna automatica delle goccioline.
Un altro passo critico, prima di eseguire il saggio, è la chiusura del coperchio dell’assieme di piastra parallela. Come indicato in precedenza nel protocollo, il coperchio deve essere scivolato sopra la piastra di attuazione. La superficie idrofobica del coperchio impedisce la distorsione e lo spostamento delle goccioline sedute sulla piastra di agiazione. Per garantire il movimento regolare della gocciolina, si consiglia vivamente di utilizzare piastra di entrata incontaminata, il caricamento corretto delle goccioline e l’assemblaggio del chip. La riusabilità delle piastre di ausilio è possibile; tuttavia, il numero di cicli dipende dalle tensioni di attuazione (Figura 3) e dalla deposizione di analita/reagente sulla superficie, noto anche come biofouling. La piattaforma presentata utilizzava chip EWOD stampato in cromo, che poteva essere riutilizzato in modo affidabile per misurazioni consecutive fino a quattro volte a tensione operativa di 120 V e pulizia della piastra intermedia dopo ogni esperimento. Le piastre sono state riciclate, per ridurre il costo per esperimento, decontaminando (spazzolando la superficie con un agente di pulizia non diluito prima di risciacquare a fondo) i fluoropolimeri amorfi biofouled (Tabella dei materiali) rivestimento e spin-rivestimento uno fresco sulla parte superiore della piastra. Tuttavia, il riciclaggio delle piastre di attuazione richiede la movimentazione manuale, reagenti costosi (fluoromeri amorfi (Tabella dei materiali)) e attrezzature specializzate (spin-coater). I chip EWOD alternativi vengono studiati con successo con substrati convenienti come carta19,pellicole in acetato o circuiti stampati (PCB)20,21. Tali materiali di consumo usa e getta possono facilitare l’uso affidabile e conveniente della piattaforma DMF e possono fornire mezzi per eludere il problema del biofouling.
Il biofouling è la principale limitazione dell’EWOD per le applicazioni biologiche22,23. Studi precedenti sul DMF hanno identificato due meccanismi che contribuiscono al biofouling, vale a dire l’adsorbimento passivo dovuto alle interazioni idrofobiche, e un adsorbente guidato elettrostaticamente che si manifesta quando viene applicato un campo elettrico24. I risultati nell’articolo corrente sono coerenti con questa teoria in quanto è stata documentata la riutilizzabilità della piastra di atuazione diminuisce a tensioni ad alta atuazione. Una possibile spiegazione è che le proteine assorbono prontamente su superfici rivestite di fluoropolimero (simile a Un teflon) e si aggregano più velocemente sui fouling rispetto alle superfici incontaminate24. Di conseguenza, i saggi relativi alle proteine sul DMF sono difficili da quantificare e possono subire perdite di analita, contaminazione incrociata e minore precisione17. Lo scenario peggiore è quando una quantità critica di proteine adsorbs rendendo così il dispositivo inutile. Per ridurre al minimo il biofouling, sono stati studiati vari approcci dal ridurre al minimo il tempo di residenza della goccia sul chip, attraverso rivestimenti23, agli additivi (cioè, surfactants o acido pluronico) nelle goccioline cariche di biomateriale6,22. Quindi un aspetto importante del test dell’immunoanalisi sull’EWOD è quello di scegliere strategie anti-biofouling compatibili con il protocollo specifico a portata di mano.
La piattaforma d’Xml automatizzata è progettata per eseguire un singolo test ELISA a sandwich per esecuzione utilizzando volumi microliter sia per reagenti che per analiti. Quando è necessario, esistono kit ELISA sandwich convenzionali basati su pre-rivestiti 96-bene o 384-bene piastre che in combinazione con attrezzature di laboratorio ausiliario si traducono in una maggiore produttività per corsa; basato solo sul prezzo dei reagenti, il costo approssimativo per analisi/pozzo è rispettivamente di 6,04 USD (580 USD/96) e 0,33 USD (2-580 USD/384). Ciò rende i metodi ELISA convenzionali ideali per un gran numero di campioni elaborati tipicamente da personale tecnico qualificato presso strutture di laboratorio centralizzate. Tuttavia, in località remote, l’analisi dettagliata dei costi di ELISA per il monitoraggio ambientale ha mostrato che quando sono stati inclusi i costi di capitale (ad esempio, i costi operativi di laboratorio, i costi aggiuntivi, il trasporto di campioni, le forniture e il personale) il prezzo effettivo per ELISA era di 60 USD di cui 34 USD erano destinati alle forniture per base per campione25. Al contrario, la piattaforma DMF proposta è portatile, richiede una formazione minima per funzionare e con perline pre-rivestite può fornire analisi campione-risposta in pochi minuti. Di conseguenza, la tecnologia presentata può essere impiegata in posizioni point-of-need e integrare le analisi altrimenti disponibili nei laboratori centralizzati.
Nella sezione dei risultati rappresentativi, la piattaforma di immunoanalisi DMF automatizzata è stata utilizzata per il rilevamento diretto di agenti patogeni per l’applicazione della difesa. Altre possibili applicazioni per la piattaforma DMF comprendono, ma non si limitano a biodiagnostiche, monitoraggio continuo e campionamento automatizzato. Potenzialmente il DMF potrebbe avere un impatto su diversi settori, dal punto di assistenza per l’assistenza sanitaria personalizzata, nonché il monitoraggio controllato dell’ambiente per la protezione dei pazienti dall’aviotrasportato dell’infezione acquisita negli ospedali, al sistema di monitoraggio delle colture per l’agricoltura e produzione alimentare.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo riconoscere il contributo dei nostri colleghi del Microfluidic & Microengineering Research Group per il loro lavoro sulla progettazione meccanica e l’integrazione dei sistemi. Gli autori desiderano ringraziare Dstl Porton Down per il loro prezioso sostegno e contributo finanziario, ai progetti passati e in corso che sviluppano ulteriormente la tecnologia DMF e le sue applicazioni.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |