Оценка T фолликулярных клеток-помощников и реакции гермального центра во время вирусной инфекции гриппа А у мышей
Summary
В настоящем документе описаны протоколы оценки tfh и GC B ответ в мышиной модели инфекции вируса гриппа.
Abstract
T Фолликулярный помощник (Tfh) клетки являются независимымиCD4 и Т-клеток подмножество специализируется на оказании помощи для развития гермызного центра (GC) и генерации антител высокого сродства. При инфицировании вирусом гриппа для содействия эффективному искоренению вируса индуцируются надежные ответные меры Tfh и GC B, что дает квалифицированную модель мыши для исследования, связанного с Tfh. В этом документе мы описали протоколы в обнаружении основных Tfh связанных иммунного ответа во время инфекции вируса гриппа у мышей. Эти протоколы включают: интраназальная прививка от вируса гриппа; окрашивание цитометрии потока и анализ поликлональных и антиген-специфических клеток Tfh, клеток GC B и плазменных клеток; иммунофлуоресценция обнаружения ДК; связанный с ферментом иммуносорбентный анализ (ELISA) специфических антител вируса гриппа в сыворотке крови. Эти анализы в основном количественно дифференциации и функции Tfh клеток в инфекции вируса гриппа, тем самым предоставляя помощь для исследований в выяснении механизма дифференциации и стратегии манипуляции.
Introduction
В последнее десятилетие, многочисленные исследования были сосредоточены на недавно выявленныхCD4 И Т-клеток подмножество, Tfh ячейки подмножество, за его основные роли в зародышевой центр (GC) B развития. B-клеточная лимфома 6 (Bcl6), которая в основном рассматривается как репрессор генов, является определяющим фактором линии клеток Tfh для доказательстватого,что эктопическое выражение Bcl6достаточно,чтобы управлять дифференциацией Tfh, в то время как дефицит Bcl6 приводит к исчезновению дифференциации Tfh1,2,3. В отличие от другихподмножества CD4 и T-помощников, выполняющих свою функцию эффектора путем миграции в места воспаления, tfh-клетки оказывают помощь клеткам группы В в основном в фолликулярной зоне В-клеточной селезенки и лимфатического узла. Состимуляторные молекулы ICOS и CD40L играют значительную роль во взаимодействии между Tfh и GC B-клеток. Во время дифференциации Tfh, ICOS передает необходимые сигналы от cognate B клеток, а также выступает в качестве рецептора, принимающего миграционные сигналы от случайных прохожих В-клетокдля локализации В-клеточной зоны 4,5. CD40L является посредником сигналов от Tfh клеток для распространения В-клеток и выживания6. Другим фактором, играющим аналогичную роль CD40L, является цитокин IL21, который в основном выделяется клетками Tfh. IL21 непосредственно регулирует развитие клеток GC B и выработку антител высокого сродства, но его роль в дифференциации Tfh по-прежнемупротиворечива 7,8. PD-1 и CXCR5, которые в настоящее время наиболее часто используются при выявлении клеток Tfh в анализе цитометрии потока, также играют значительную роль в дифференциации и функции этого подмножества. CXCR5 является рецептором В-клеточного фолликулярного хемокина и опосредует локализацию клеток Tfh в В-клеточных фолликулах9. PD-1 в настоящее время определены не только имеют фолликулярную функцию наведения, но и передавать критические сигналы в процессе сродства клеток GC Bсозревания 10. Основываясь на этих выводах, оценка экспрессии этих молекул может в основном отражать созревание и функцию клеток Tfh.
GC является индуцированной переходной микроанатомической структуры во вторичных лимфоидных органов и сильно зависит от Tfh клеток, таким образом, является идеальным считывания для оценки Tfh ответ. В GC, после получения сигналов, опосредовающихся цитокинами и состимуляторными молекулами, В-клетки подвержены классу переключения и соматической гипермутации для генерации антителвысокого сродства 11. Переключение дифференциального класса антител происходит в дифференцированной нише цитокинов, в которой IL4 и IL21 индуцирует переключение класса IgG1, в то время как ИФНЗ индуцирует переключениекласса IgG2 12. Плазменные клетки являются производителями секретных антител и являются неизлечимо дифференцированными клетками. Как и tfh клетки, развитие В-клеток в GC связано с динамическим выражением многих значительных молекул. Основываясь на текущем исследовании, клетки GC Bмогут быть идентифицированы как B220 – PNA–Fas– или B220–GL7–Fas– клетки и плазменные клетки, по сравнению с их предшественниками, downregulate выражение B220 и upregulate CD138выражение 13. Более того, обе эти характеристики могут быть обнаружены в цитометрии потока и иммунофторесценции анализа, таким образом, является надлежащей оценкой реакции ГК.
Надежные клеточные и гуморальные реакции индуцируются при заражении вирусом гриппа, с Tfh и Th1 клетки доминирующейCD4 T-клеток ответ 14, что делает его идеальной моделью для Tfh клетки дифференциации исследования. Грипп A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8), который является широко используемым штаммом, адаптированным к мыши, часто используется вданном исследовании 14,15,16. Здесь мы описываем некоторые основные протоколы Tfh исследования соответствующих анализ в инфекции вируса гриппа: 1) интраназальной прививки от вируса PR8; 2) антиген-специфические клетки Tfh, клетки GC B и плазмы и обнаружение IL21 с цитометрией потока; 3) гистологическая визуализация ГК; 4) обнаружение антиген-специфических антител титр в сыворотке крови с ELISA. Эти протоколы обеспечивают необходимые методы для новых исследователей в Tfh связанных исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за специализированных ролей в предоставлении B-клеточной помощи для генерации антител высокого сродства, Tfh клетки были широко изучены в механизмах дифференциации и манипуляции, чтобы обеспечить новые стратегии для разработки вакцины. Инфекция вирусом гриппа вызывает энергичные о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим сотрудников предприятия по цитометрии потока, объекта ABSL2 и животноводского комплекса SPF Института Пастера в Шанхае за техническую помощь и консультации. Эта работа была поддержана следующими грантами: Стратегическая приоритетная исследовательская программа Китайской академии наук (XDB29030103), Национальная ключевая программа НИОКР Китая (2016YFA0502202), Национальный фонд естественных наук Китая (31570886).
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
